外泌体作为细胞间通讯的关键介质，在多种病理过程中发挥着重要作用，尤其在肿瘤发生和发展中备受关注。因此，开发有效的肿瘤来源的外泌体分离和分析方法对于了解其产生和分泌机制具有重要意义。目前，基于外泌体独特的物理和生物学特性，已开发出多种分离与分析技术。免洗外泌体分离和分析方法因其操作简便、能有效减少蛋白质损失、提高纯度等优势，已成为外泌体研究热点之一。这类方法虽避免了传统技术中繁琐的多步洗涤步骤，但目前大多数免洗方法仍局限于单一识别元件，对于特异性的肿瘤来源外泌体分离与分析仍面临重要挑战。
湖南大学王青教授团队在ACS Sensors杂志上发表题为“Wash-Free Isolation and Quantification of Tumor-Derived Exosomes via In Situ-Formed Hydrogel”的研究论文，主要介绍了一种基于水凝胶免洗的乳腺癌外泌体分离和检测方法，为乳腺癌来源外泌体的有效分离和检测的提供了一种新的策略，有助于促进外泌体在乳腺癌研究中的应用。王青教授为该论文的通讯作者，博士研究生王宏强为第一作者。
该研究中选择乳腺癌细胞外泌体作为靶标，开发了一种基于水凝胶的免洗、免酶释放的有效分离和检测策略（图1）。利用双核酸适配体（CD63-T1/EpCAM-T2）特异性识别捕获乳腺癌细胞外泌体，并在外泌体表面触发海藻酸钠修饰的发夹探针形成HCR纳米结构，在Ca2+诱导下原位形成水凝胶，从而实现乳腺癌细胞外泌体的特异性、免洗分离和检测。利用EDTA与Ca2+的经典螯合反应，实现外泌体的无酶释放。外泌体的捕获和释放效率分别约为85%和98%，并且基于水凝胶方法分离出的外泌体保留了良好的生物活性，同时，可检测低至3.2×103particles/mL的乳腺癌细胞外泌体。该工作为有效分离和检测肿瘤来源的外泌体提供了新策略，有助于外泌体在乳腺癌早期诊断和治疗中的应用。
图1. 基于水凝胶用于乳腺癌外泌体的分离和检测示意图
将该方法用于细胞上清液、人血清中靶标的检测，发现细胞上清液中靶标的检测结果与缓冲溶液中靶标结果基本一致。更重要的是，该策略还可区分乳腺癌患者（15例）和健康人（9例），ROC曲线的AUC值为1.0（图2）。
图2. 基于水凝胶方法对复杂样品中乳腺癌外泌体传感性能的研究
通过扫描电子显微镜（SEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫蛋白印迹（Western Blot）对分离的外泌体进行表征，发现该分离外泌体的方法具有优异的分离性能，无需多次洗涤和超速离心，有效减少了蛋白质的损失，所分离的外泌体纯度高（图3）。
图3. 基于水凝胶方法对乳腺癌细胞外泌体分离性能的研究
参考文献：
Wash-Free Isolation and Quantification of Tumor-Derived Exosomes via In Situ-Formed Hydrogel. ACS Sensors. 2025 May. DOI: 10.1021/acssensors.5c00204.
