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暨南大学JEV:优化的SEC分离策略用于临床批量纯化细胞外囊泡

 ​细胞外囊泡在临床诊断中的重要性愈发受到重视,但是目前从复杂体液中分离细胞外囊泡的技术策略依旧不够成熟。如何进行大通量的简便而高效的分离纯化细胞外囊泡依旧是临床应用所面临的主要问题之一。虽然,近期已有大量研究关注微流控用于细胞外囊泡临床大通量分离纯化的策略,但其他方法在临床应用的可行性还缺乏探讨。近日,来自暨南大学附属第一医院的王通教授和CuiYizhi研究组对凝胶排阻层析(SEC)策略用于临床大通量简便高效分离细胞外囊泡进行了优化和改进并取得了不错的结果。该成果以“Establishment of a simplified dichotomicsize-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles towardclinical applications”为题,发表在近期的Journal ExtracellularVesicles上。
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细胞外囊泡 (EVs) 是细胞衍生的膜包被颗粒,具有多样化的生物学或病理学功能。根据它们的生物发生和特征,EV 可以大致分为外泌体和微泡 (MV)。一般来说,外泌体是直径为 30-200 nm 的 EV,随着多泡内体 (MVE) 的成熟而在细胞内形成。如果不考虑细胞内来源,与外泌体大小相似的 EV 可以统称为小 EV(sEV)。在 MVE 的膜与细胞的质膜融合后,可以释放外泌体。与外泌体不同,MVs 是更大的 EVs,其典型尺寸的直径范围为 500 到 1000 nm。 MVs 主要通过质膜的直接出芽形成,然后是细胞外释放。然而,EV往往有更复杂的亚群。例如,Kowal 等人通过蛋白质组学分析发现,从人类树突状细胞中分离出的不同 EV 亚型具有共同的生物标志物,例如 flotillin 和热休克 70-kDa 蛋白 (HSP70),同时还有一组 5 种蛋白质具有不同种群的不同相对丰度。EV 亚群之间的差异功能和特征仍不清楚。但是,人们普遍认为 EV 在各种人类疾病的诊断、预后和治疗方面具有有前景的价值,因为它们携带组织和/或器官衍生的生物分子,如蛋白质、RNA、DNA 和脂质。
 
EV 生物标志物研究面临着许多挑战,尤其是在将分离和表征方法标准化为临床应用方面。此外,样本收集、存储、分析方法和样本大小在任何 EV 生物标志物的验证阶段都具有重要意义。正如 2018 年EV研究的最少信息 (MISEV2018)和国际细胞外囊泡协会 (ISEV) 的其他立场文件所强调的那样,在任何后续分析之前,分离纯化的 EV 是最重要和最困难的先决条件之一。特别是,将 EV 从复杂体液中分离出来,往往在纯度和操作简便性之间进退两难,而这两者对于现实世界的临床应用都至关重要。在 30 多种生物流体中,血浆/血清是生物标志物发现和疾病诊断中使用最广泛的样本类型之一。然而,血浆/血清中有多种生物分子或生物纳米颗粒,其大小和/或密度与 EV 相似,主要包括脂蛋白、亚细胞器、细胞碎片和病毒颗粒。其中,低/极低/高密度脂蛋白是 EV 分离中最常见的污染物之一,因为血浆中的脂蛋白含量约为 10^16 个/毫升。 MISEV2018建议可以分析和报告几类蛋白质标记来证明 EV 纯度,包括那些显示 EV 存在以及常见共分离的污染物的消耗。此外,每蛋白质单位的粒子比(粒子/蛋白质比)也是估计 EV 纯度的重要参数。此外,使用纳米流式细胞术 (nFCM) 通过 Triton X-100 可破坏颗粒与总颗粒的比率来估计 EV 纯度的也是一种可行的间接方法。
 
在目前的观点中,超速离心 (UC),尤其是密度梯度 UC 是最被接受的高纯度 EV 分离方法之一。但是 UC 不容易用于医学实验室,因为它通常耗时、粒子回收率低并且需要特定仪器。而基于过滤或沉淀的方法存在严重的蛋白质污染或引入外源化学物质的问题。相比之下,尺寸排阻色谱 (SEC) 提供了一种重要的选择,可以绕过特定仪器的需求,同时分离纯度与 UC 相当的 EV。
 
SEC 使用聚合物在色谱柱中形成多孔固定相,允许不同尺寸的颗粒通过重力流或使用液相色谱系统进行差异洗脱。尽管已知乳糜微粒、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白不能完全去除,但 SEC 可以有效地将 EV 从体液中的大多数高丰度蛋白质污染物(如白蛋白)中分离出来。
 
大多数 SEC 分离 EV 的研究需要收集大约 26 个洗脱液馏分,其中一些馏分可以合并用于 EV 分析。事实上,对于临床应用,我们认为使用重力流 SEC 进行 EV 分离的简化分离方法具有惊人的需求。为了解决这个问题,需要对 SEC 的三个方面进行评估。首先,需要充分解决树脂的选择问题。交联 (CL) Sepharose树脂是 EV 分离中最常用的SEC基材料之一;然而,这些材料的性能比较尚未得到充分阐释。其次,应优化 EV 分离的柱床体积。 10 ml 的床体积是 SEC 中最受欢迎的设置;对于具有相同内径的色谱柱,已有研究表明增加床体积可能会导致更好的分离性能。但是,至少根据同行评审的出版物,到目前为止,根据我们的知识,这种假设尚未在床体积大于 10 ml 的重力流柱中得到验证。第三,使用上述树脂和床体积组合,分离方案应尽可能简单,即使是未经培训的医学实验室人员也可以操作。
 
在本研究中,我们逐步解决了上述三个问题。 具体而言,我们比较了所有三种 Sepharose CL 树脂的性能,即 CL-2B、CL-4B 和 CL-6B,然后是柱床体积优化。在这些优化的条件下,我们证明了具有 2 个批量洗脱步骤的二分 SEC 分离足以从胎牛血清 (FBS)、人血清 (HS) 和无FBS 的细胞培养上清液中以高纯度和颗粒回收率分离 EV速度。这种简化的 EV 分离方法具有可用于临床环境的优势。
 
参考文献:Establishment of a simplified dichotomic size-exclusionchromatography for isolating extracellular vesicles toward clinicalapplications

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