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Nature子刊:外泌体被摄取及其组分胞质释放的定量分析

包括外泌体在内的细胞外囊泡(EV)被认为通过将其“货物”从供体转移到受体细胞来介导细胞间的通讯。受体细胞内是否存在EV组分传递尚未得到明确证明,更不用说量化了,并且仍在争论中。来自法国巴黎文理研究大学的研究人员在Nature Communications杂志上发表文章,报道开发了一种基于细胞的分析方法,将包含荧光素酶或荧光蛋白标记组分的EV装载到未标记的受体细胞上,从而对EV/外泌体被细胞摄取及其组分在靶细胞内的释放进行定量分析。
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细胞外囊泡(EV),包括外泌体和微囊泡,包含核酸、蛋白质和脂质等货物。像许多其他交流载体一样,EV通过激活受体细胞表面的受体来介导细胞间的通信。另外,已经提出了EV将膜封装的货物从供体细胞转移至受体细胞,并影响后者的表型。肿瘤细胞释放的EV通常被描述为影响肿瘤周围细胞促进其自身生长和传播的工具。
EV通过多种细胞类型和多种途径被内化/摄取。内毒素/溶酶体靶向通常是病毒内容物递送的先决条件,在某些情况下,其受酸性内毒素/溶酶体pH控制,该pH触发病毒与内毒素/溶酶体膜之间的融合。研究人员之前使用无细胞系统等研究表明,EV组分的传递依赖于类似的pH依赖机制。然而,在受体细胞内EV组分释放的真正发生仍存在争议,并且从未经过严格的论证和量化
到目前为止,仅对EV的摄入量进行了定量评估。此外,关于EV的摄取方式尚无共识,这可能是受体依赖性的,也可能不是受体依赖性的。例如,已经提出了几种细胞表面分子在EV捕获中发挥作用,但似乎没有一个是必需的和充分的。另外,没有表征EV货物在受体细胞内的命运。EV货物可通过在新形成的EV中循环利用而释放到细胞质中,在溶酶体内降解或在细胞外培养基中重新分泌。
该研究将完善的定量经典生物化学与定性和定量亚细胞共聚焦成像相结合,以追踪通用EV胞质货物的命运,并测量EV捕获和将内容物转移到受体细胞中的实际功效。结果表明,EV组分的释放需要内体酸化和膜融合。
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内体/溶酶体酸化是EV内含物输送所必需的
剂量反应、动力学和温度阻断实验的结果表明,EV摄取是一个低效率的过程(在1 h时自发率约为1%)。通过膜和细胞溶胶的分级,进一步表征了这种有限的EV摄取,揭示了受体细胞中的胞质释放(约占摄取的EV的30%)。这种释放被杆状霉素A1和IFITM蛋白的过表达抑制,它们阻止病毒的进入和融合。结果表明,EV组分的释放需要内体酸化并提示膜融合的参与。
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EV组分胞质释放定量的原理:来自EV组分NLuc-CD63(膜标记)或NLuc-Hsp70(胞质标记)的信号应与膜级分(membrane fraction, Mb)相关联,除非发生组分释放。然后,应仅在胞浆级分(C)中检测到NLuHsp70。

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IFITM蛋白抑制EV组分的传递
参考文献:
BonsergentE, Grisard E, Buchrieser J, Schwartz O, Théry C, Lavieu G. Quantitativecharacterization of extracellular vesicle uptake and content delivery withinmammalian cells. Nat Commun. 2021 Mar 25;12(1):1864.PMID: 33767144.

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