细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞分泌的具有脂质双层结构的颗粒，参与多种生理功能。根据直径大小，EVs可分为小型EVs（sEVs，30–200 nm）和大型EVs（lEVs，>200 nm）。它们的来源包括由内体生成的外泌体和直接分泌的囊泡等。最初EVs被视为细胞代谢废物，但近年来研究表明，EVs在细胞通信中发挥重要作用，其功能由所携带的蛋白质、脂质及遗传物质（如microRNA、RNA和DNA）决定。不同亚型的EVs在生成机制、大小及货物内容上存在差异，这种异质性赋予其在细胞通信及免疫调节中的多样性表现，也使其在生物医学领域具有广阔应用前景。
EVs在癌症检测、药物递送及再生医学中表现出巨大潜力。其携带的肿瘤特异性蛋白、突变DNA等可用于早期癌症（如结肠癌、肺癌和胰腺癌）的无创检测。此外，来源于肿瘤细胞、免疫细胞或干细胞的EVs可作为天然纳米载体，用于药物递送，既能保护内部货物，又能穿透细胞膜，精准输送到病变细胞，实现个性化治疗。再生医学中，干细胞来源的EVs因其促进细胞增殖、血管生成及免疫调节的能力，在组织修复与再生中表现突出。
然而，EVs的大规模生产仍是制约其研究和临床应用的主要挑战。传统培养方法产量有限，难以满足实验和治疗需求。尽管生物反应器已被用于大规模生产，但细胞生长动力学和细胞来源的差异仍限制了EVs的数量和质量。此外，不同EV亚群的生物学效应和相互作用也可能影响其治疗效果。因此，如何高效获得高纯度、特异性的EVs仍是亟待解决的问题。
近日，发表在Bioactive Materials杂志上的一篇综述介绍了EVs的生物生成与分泌途径，探讨提升产量的关键因素（如3D培养、培养基成分和外部刺激），并分析包括超速离心和微流控技术在内的先进分离方法。此外，还讨论了新型EVs（如细菌/植物衍生的EVs及合成EVs）以及临床转化面临的难题。随着对EVs生物学的深入理解和技术的不断创新，EVs的大规模生产及其临床应用有望取得突破性进展。
一、提升EVs产量的方法
EVs广泛存在于细胞分泌的液体中，如培养基和多种体液。然而，这些液体来源的局限性及伦理问题限制了其广泛应用，因此细胞培养基成为主要的EVs分离来源。然而传统生产方法面临产量较低的问题，难以满足临床应用需求。EVs生产受限的主要原因包括：EVs分泌与生产的生理过程较为复杂，调控效率较低；以及传统二维（2D）培养体系的限制，难以实现高效生产。为克服这些挑战，研究提出了多种提升EVs产量的策略，主要分为三大方向：采用三维（3D）培养方法、优化培养参数及外部机械刺激。
1.三维（3D）培养方法
3D培养通过模拟细胞微环境显著促进细胞生长与增殖。有研究表明，3D培养体系的EVs产量显著高于2D体系。此外，水凝胶支架作为另一种3D培养方法，通过提供细胞附着位点和模拟细胞外基质（ECM）环境，有助于维持细胞干性并提高EVs产量。然而，水凝胶的规模化应用受限于批次间差异性和可扩展性。类似地，微球载体和无支架方法（如悬滴法和磁性组装技术）也被广泛用于3D细胞培养，尽管这些方法在扩展性和营养供应方面存在一定局限性。
2.培养参数优化
多种环境参数（如pH值、温度、氧气浓度、培养基成分和化学刺激）均会显著影响EVs分泌。研究表明，在酸性环境（如pH=6.5）下，EVs产量可增加24-78倍。然而，低pH对正常细胞的影响尚需进一步研究。另外，缺氧条件下也观察到EVs分泌增加，例如在1%氧气水平下，EVs产量较常氧条件提高1.9倍。温度变化也会影响EVs分泌，热应激处理（如45°C短时间处理）可使EVs产量翻倍。此外，培养基的成分（如血清和葡萄糖）对EVs产量也有显著影响。例如，血清饥饿培养可显著提高某些干细胞和癌细胞的EVs产量，但不同细胞类型的反应存在差异。
3.外部机械刺激
机械刺激（如剪切应力、声波力和电刺激）是促进EVs分泌的重要手段。其中，剪切应力通过调控细胞骨架结构促进EVs分泌，但过高的剪切力可能触发细胞应激反应，从而抑制囊泡生成。声波刺激（如高频声波）也能提升EVs分泌，研究表明声波刺激可通过增加细胞膜通透性或热效应促进囊泡释放。电刺激则通过激活细胞内信号通路（如钙离子浓度变化）显著提高EVs产量，某些研究观察到电刺激下EVs产量增加可达50倍。然而，这些方法在刺激参数标准化和GMP级生产中的适用性方面仍需进一步研究。
4.生物反应器
生物反应器通过精准控制动态培养环境，为大规模细胞培养与EVs生产提供了可能性。旋转瓶、垂直轮和灌流式生物反应器等多种设计已被广泛应用。例如，旋转瓶生物反应器可用于培养悬浮细胞或附着在支架上的细胞，研究表明3D体系中EVs产量比静态培养高出20倍。此外，灌流式生物反应器通过持续供给培养基和排出代谢废物，显著提高了细胞密度和EVs产量。中空纤维生物反应器因其半透膜设计，可提供适宜的营养与代谢环境，目前已被用于大规模EVs生产。然而，生物反应器在剪切力梯度、氧气分布和流体均匀性控制方面仍面临挑战，这些因素可能导致EVs大小、货物和功能的不均一性。
二、EVs分离方法
尽管现有技术已能实现EVs的大规模获取，但纯度低和分离标准不一致仍然限制了EVs的进一步发展。EVs分离方法主要基于其物理性质（如大小、电荷和密度）。其中，超速离心（UC）是最常见的方法，通过离心力依据EVs的大小和密度分离特定大小的囊泡群。然而，UC需要专用设备，且操作复杂、耗时。此外，超滤（UF）、尺寸排阻色谱（SEC）、聚合物沉淀（PP）和膜分离等方法也被广泛应用于EVs分离，但这些物理方法常导致EVs纯度不高。为提高纯度，还开发了化学和生物方法，如免疫亲和分离和分子印迹技术。以下是主要分离方法的综述：
1.超速离心（UC）
UC通过离心力按颗粒密度分离样品，包括差速离心和密度梯度离心。差速离心被认为是分离EVs的“金标准”，通过逐步提高离心力去除细胞残骸和大颗粒物，最终在100,000–150,000 g条件下获得纯化的EVs。然而，UC分离的囊泡可能包含蛋白质聚集体、病毒和其他外源成分。密度梯度离心利用梯度溶液（如蔗糖或碘克沙醇）进一步纯化，通过不同密度分层分离EVs。尽管这种方法能提高纯度，但操作复杂、耗时（通常需17小时）。结合UC与梯度离心可在6小时内完成分离，但仍存在损害EVs结构及活性的风险。
2.超滤（UF）
UF通过膜的孔径大小实现快速分离，比UC更高效（分离时间20分钟对比UC的180分钟），特别是对小于100 nm的囊泡回收率高约40%。UF分为离心驱动和压力驱动两种方式，后者如切向流超滤（TFF）可避免膜堵塞，提高分离效率。研究表明，TFF比UC获得的EVs数量高27倍，且膜完整性更佳。但UF的缺点包括膜容易被污染和堵塞，以及高强度驱动力可能损害囊泡形态。改良技术如结合磁珠免疫吸附或振动装置，可显著提高分离效率和纯度。
3.尺寸排阻色谱（SEC）
SEC通过分子量差异分离样品，利用填充特定孔径的凝胶微球实现分离。SEC的优势在于分离过程中低压或重力驱动，不影响EVs结构和功能。研究显示SEC分离的EVs结构完整，无融合现象，并具备较强的生物活性。然而，SEC面临大小重叠问题，EVs常与脂蛋白和可溶性蛋白共洗脱。通过调整树脂孔径、柱体积和样品体积等参数，可优化分离效果。SEC与其他技术（如UF）结合使用，可进一步提高分离纯度。
4.聚合物沉淀（PP）
PP通过改变EVs溶解性或分散性实现分离，常用聚乙二醇（PEG）作为沉淀试剂。PP方法操作简单，可在60分钟内分离更多小型EVs，且较UC分离的EVs具有更强的生物活性。然而，PP方法选择性差，沉淀物中常含大量蛋白杂质。改进方法包括利用特异性凝集剂（如凝集素）或结合其他分离技术（如UC）以提高纯度。
5.免疫亲和分离
免疫亲和分离基于抗原与抗体的特异性结合，利用EVs膜上的标志蛋白（如CD9、CD63、CD81）实现高特异性分离。抗体通常固定在磁珠或微流控设备上，结合效率高，适用于特定EVs亚群的分离。然而，该方法成本高，回收效率低，不适合大规模生产。改进技术如分子印迹技术和抗体修饰磁珠可提高分离效率，但仍主要用于小样本的高特异性分离。
6.微流控技术
微流控技术通过尺寸选择性、亲和捕获或结合外部力场（如声场、电场、磁场）实现EVs的高通量分离。尺寸选择性微流控设备利用特定孔径的膜或设计精密的流道结构分离不同大小的囊泡。亲和捕获技术常在微流控通道内涂覆抗体或结合磁珠实现特定EVs的捕获。外部力场如声波和电场则通过改变囊泡的运动轨迹提高分离效率。尽管微流控技术具有快速、高纯度分离的优势，但其处理量有限，难以满足大规模生产需求，且对高黏性样本的适用性较低。
三、天然与人工EVs
为提高EVs的获取效率，研究者探索了天然非哺乳动物细胞来源的EVs及人工工程化EVs。天然EVs的潜在主流来源包括细菌、脊椎动物、植物、原生生物和无脊椎动物，其中细菌和植物来源的EVs尤为突出。人工EVs则通过合成或修饰优化天然EVs的性质，旨在实现特定的生物医学目标，如药物递送、疾病治疗和基因疗法。
1.细菌来源的EVs（BEVs）
BEVs在生物膜形成、免疫调节等方面发挥重要作用，可作为新型疾病诊断标志物、疫苗及药物递送工具。BEVs具有较高的免疫原性，因其携带脂多糖（LPS）、核酸及肽聚糖等免疫刺激成分，被广泛应用于细菌疫苗开发。然而，高浓度LPS的毒性需通过基因工程或化学方法降低。此外，BEVs具有膜结构、纳米尺度和优异的货物负载能力，通过基因改造或共孵育等方式可将小分子RNA、抗原蛋白及药物装载入囊泡。研究发现，BEVs可跨越血脑屏障，应用于神经保护等治疗领域。此外，BEVs还具备内在抗菌特性，可与多功能纳米材料结合用于抗菌疫苗及肿瘤治疗。然而，BEVs的生物异质性和毒性问题仍需解决，目前需通过优化分离与纯化方法（如切向流超滤和密度梯度离心）提高其临床应用潜力。
2.植物来源的EVs（P-EVs）
P-EVs在细胞通信及货物转运中与其他EVs功能相似，同时在植物防御外来病原体方面具有独特作用。P-EVs含有与细胞壁形成相关的成分，可提升植物抗逆性。研究表明，P-EVs分泌的小RNA通过沉默病原基因表达发挥防御功能。此外，P-EVs因其丰度高、免疫原性低、稳定性强，在药物递送和癌症治疗中展现了巨大潜力。P-EVs还被用于组织修复，因其具有免疫调节和促进血管生成的能力。然而，目前P-EVs的分离缺乏标准化协议，植物细胞壁的存在也可能影响囊泡提取效率，需要进一步研究以建立可靠的标记物和分离方法。
3.人工EVs
天然EVs存在靶向性有限、货物负载能力不足等问题，研究者通过直接修饰、基因工程及纳米颗粒结合等策略开发人工EVs。例如，通过点击化学在EV表面连接功能分子，或将功能性纳米颗粒装载入囊泡，用于肿瘤治疗和基因递送。此外，研究者通过膜挤出、超声处理及反复冻融等方法人工合成囊泡，产量显著高于天然分泌的EVs。然而，这些方法在实际应用中仍面临膜堵塞、囊泡稳定性及规模化生产等挑战。
四、EVs临床应用的挑战
尽管EVs在生产、分离及替代来源探索方面取得了显著进展，但其临床转化仍面临诸多挑战，包括监管审批、安全评估、成本及质量控制等问题。哺乳动物来源EVs存在产量低、异质性高及安全隐患；植物和细菌来源EVs虽具规模化优势，但缺乏标准化生产和分离协议，并存在毒性风险。分离技术难以在纯度与产量间平衡，且缺乏统一标志物和效力检测方法。FDA批准的EV药物有限，稳定性、代谢分布及临床数据仍需深入研究。MISEV2023指南强调多参数表征和GMP标准生产。未来需优化技术、加强质量控制及标准化，推动EVs在精准医疗中的转化应用。
五、总结与展望
EVs因其在细胞通信及生物医学中的重要作用，已成为研究热点。提升EVs产量的策略包括增加单细胞EVs分泌、扩大细胞培养规模及探索非哺乳动物来源（如植物、细菌及人工囊泡）。3D培养体系（如生物反应器）及基因工程技术在提升产量中作用显著。人工EVs通过优化表面标记、尺寸及货物配置，展现出靶向递送及刺激响应的潜力。分离技术方面，优化的超滤及微流控平台可提升纯度与灵敏度。临床应用面临异质性、标准化及数据处理等挑战，AI和机器学习有助于解析复杂数据、筛选生物标志物及个性化治疗。未来需加强多学科合作与数据共享，加速EVs的临床转化。
参考文献：
Huang J, Chen H, Li N, Liu P, Yang J, Zhao Y. Emerging technologies towards extracellular vesicles large-scale production. Bioact Mater. 2025 Jun 13;52:338-365. doi: 10.1016/j.bioactmat.2025.06.005. PMID: 40585384; PMCID: PMC12206051.
