许多生物过程离不开动态的蛋白质磷酸化调节，因此监测循环生物体液中与疾病相关的磷酸化事件意义非凡，然而，由于磷酸酶的存在使得监测生物体液中磷酸化蛋白的变化极具挑战性。近期，东南大学W. Andy Tao教授团队在Angewandte Chemie在线发表了题为Profiling Phosphoproteome Landscape in Circulating Extracellular Vesicles from Microliters of Biofluids through Functionally Tunable Paramagnetic Separation的研究文章。
该研究介绍了一种功能可调的材料和方法：从细胞外囊泡到磷酸化蛋白-------EVTOP(Extracellular Vesicles To Phosphoproteins)，它实现了一步法分离、提取和消化EV蛋白，并富集了磷酸化肽段，而且只需微量的起始生物液。用钛(IV)离子功能化的磁珠和穿膜肽八精氨酸（ R8+）有效地分离EV，同时R8+提供了亲水表面以在裂解过程中保留EV蛋白。随后磁珠上消化的同时将EVTOP转化为纯Ti(IV)离子表面，有效地富集了磷酸化肽。这个简化的超灵敏平台能够仅用几个μL血浆就能定量500个独特的EV磷酸化肽，用100μL脑脊液（CSF）就能定量1,200多个磷酸化肽。该团队还探讨了小容量CSF监测原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL，Primary Central Nervous System Lymphoma)化疗效果的临床应用，为临床的广泛应用提供了有力工具。
图1. 实验流程示意图上图简要展示了该团队从微量体液中分离肠道病毒并原位富集磷酸化肽用于深度磷酸化蛋白质组图谱的研究方法。
图2. 关于EVTOP磁珠制备及EV分离的表征
图3. 胰酶处理EVTOP磁珠对EV捕获率的影响经胰酶消化后的EVTOP磁珠的捕获EV效率明显下降，同时Zeta电位发生变化。WB结果和质谱学鉴定进一步证实了R8+和Ti(IV)离子的重要作用。通过在胰酶消化过程中同时切割R8+，EVTOP被转化为纯Ti(IV)离子磁珠。
PCNSL是一种罕见的仅限于中枢神经系统的非霍奇金淋巴瘤亚型，作为一种具有复杂发病机制的高度异质性疾病，PCNSL的分子特征至关重要，CSF是准确评估疾病的理想微创生物液体。以前使用大量CSF样本的尝试只发现了少量的磷酸化蛋白。为了展示EVTOP的临床应用，该团队首先使用EVTOP方法分析了21例PCNSL患者和21例匹配的非PCNSL对照CSF样本的EV磷酸化蛋白质组学定量。
图4.临床CSF样本本分析过程及结果。该团队总共从CSF样本 EVs中鉴定出3,344个磷酸化肽，代表689个磷酸化蛋白，其中160个磷酸化蛋白在PCNSL患者中上调。GO、KEGG途径和PPI分析表明，上调的磷酸化蛋白参与神经肽激素活性、透明质酸结合和多种信号途径，如Wnt信号和PI3K-Akt途径。其中一些上调的磷酸化蛋白被报道为PCNSL和其他癌症的潜在生物标记物，如骨桥蛋白(SPP1)，组织蛋白B(CTSB)，纤维连接蛋白(FN1)，CD44，Tenascin-X(TNX)，肉豆蔻酰化丙氨酸C-激酶底物(Marcks)和Testican-3(SPOCK3)。
该团队选择了11名PCNSL患者的独立队列，这些患者最初接受大剂量甲氨蝶呤治疗，总体临床反应良好。分别于化疗前和化疗后采集CSF标本100ug。然后对CSF样本进行EVTOP程序以获得EV磷酸化肽。使用TimeTOF Pro仪上的平行反应监测和平行累积-连续碎裂(PRM-FASEF)相结合的方法来监测化疗前后这些上调的磷酸化蛋白的强度变化。排除了重复性相对较差、产物离子覆盖率较低、缺乏生物学意义(无疾病或相关生物途径关联)的磷酸化肽。
发现10个磷酸化蛋白【SPP1、促甲状腺激素释放激素原(TRH)、Tenascin-C(TNC)、硒蛋白P(SEPP1)、纤维蛋白原β链(FGB/FIBB)、层粘连蛋白β1(Lamb1)、TNX、富组氨酸糖蛋白(HRG)、高尔基相关蛋白1B(GAK1B)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(fbp5/IBP5)】在化疗后显示出明显的信号减少。此外，Reatcome/KEGG通路分析和PPI分析表明，这其中6个属于脑组织，这些生物标记物大多参与PI3K-Akt、PI3K-Akt-mTOR和其他重要的信号通路，据报道与PCNSL的发生和发展有关，并成为各种癌症和神经退行性疾病的治疗靶点。
磷酸化蛋白SPP1、TRH、TNC、SEPP1、IBP5和TNX与神经系统疾病相关，其中SPP1是PCNSL筛查的生物标志物。该团队能够从治疗前和治疗后的100μL CSF样本中定量它们的事实，突显了EVTOP方法的强大和未来应用的巨大潜力。
该研究介绍的EVTOP磁珠有希望用于处理大样本批次、有限样本材料和具有挑战性的生物样本的临床筛查和生物标记物发现。该研究展示了EVTOP用于使用微量生物流体进行EV磷酸化蛋白质组谱分析的优势，未来改进该方法可以扩展到含有其他翻译后修饰的EV多肽的富集化，例如糖基化、乙酰化和其他修饰。EVTOP由于其超高灵敏度和稳定性，可以作为一种临床程序来筛选或靶向循环EVs中的功能蛋白，用于疾病诊断。
