近日，加拿大渥太华大学的研究人员在Nature Biomedical Engineering杂志（影响因子17.135）上发表文章，通过将小干扰RNA与高度富集的pre-microRNA的骨架整合内源性表达，并将其包装到细胞外囊泡中，可以降低小干扰RNA的治疗用剂量；有望提高EVs作为载体递送siRNA治疗疾病的效果，并减少副作用。
pre-microRNAs（pre-miRNAs）是60-120个核苷酸（nt）的茎环结构，被核糖核酸酶（RNase）III酶Dicer切割成短的，约21 nt的双链（ds）RNAs。该21 nt dsRNA复合物与microRNA效应子Argonaute（Ago）结合。去除一条RNA链后，Ago-miRNA复合体通过翻译抑制和mRNA降解抑制目标基因的翻译。 siRNA被设计成模仿Dicer处理的结合Ago的dsRNA，并用于治疗。当siRNA与mRNA靶标完美互补时，Ago2可以酶切靶标mRNA，从而赋予这些药物非凡的效能和特异性。
对于治疗应用而言，将siRNA递送到细胞质是一项长期的挑战。定量分析表明，在每个细胞的细胞质中需要300-2,000个可催化切割mRNA的siRNA拷贝才能沉默目标mRNAs。例如，将siRNA直接显微注射到细胞质中时，每个细胞需要300份siRNA才能使靶标表达沉默50％。或者，需要800份siRNA加载到Ago2中才能有效地沉默肝脏中的靶mRNA。在培养的细胞或小鼠肝脏中进行测量，目前的转运载体（如脂质纳米颗粒）只能使0.05％到1％的siRNA进入细胞的细胞质。因此，需要高剂量的siRNA及其递送载体才能达到患者的治疗剂量。但这样可能会导致毒性，从而终止了沉默RNAs的多项临床试验。脂质纳米颗粒和siRNA主要在肝脏中积累。因此，大多数siRNA治疗药物靶向在肝脏中表达的蛋白质。用脂质纳米颗粒将siRNA输送至肝脏可在6个月内以单剂量将患者的靶基因表达降低80％以上，并且最近被批准用于运甲状腺素蛋白淀粉样变性病的治疗。siRNA传递到其他器官仍然是一个重大挑战。
已有很多研究提出细胞外囊泡，特别是小的细胞外囊泡作为siRNA的递送载体。小细胞外囊泡（sEVs）可以通过从质膜出芽或将60-120 nm囊泡在晚期内体中出芽产生。这些晚期的内体可随后与质膜融合，将其内部的sEV释放到细胞外空间。研究表明，细胞外囊泡和sEVs含有miRNA，可以将miRNA的活性转移到其他细胞中。人们提出了一种假设，即EVs具有的在细胞之间传递小RNA或其他分子的能力，并且可以利用这种能力进行有效的药物传递。但是，在某些情况下，无论将siRNA电穿孔进入sEV还是直接注射入小鼠，都无法达到有效的靶基因沉默。如果将siRNA用sEV电穿孔或涂在sEV表面，则敲低靶基因表达所需的siRNA剂量明显超过脂质纳米颗粒中siRNA所需的剂量。这表明，sEV实际上可能几乎没有传递RNA的固有能力。
模式图：将miRNA和siRNA分选进细胞外小泡
迄今为止，关于使用sEV进行siRNA递送的研究可能尚未测试sEV的实际递送效率。如果sEV与靶细胞融合，则sEV外部的siRNA不会进入细胞质，而是会留在内体或细胞外部，从而失活。同样，用siRNA电穿孔sEV可能实际上不会将siRNA引入sEV中，而是使siRNA沉淀，然后与sEV共纯化。电穿孔或以其他方式改变sEV表面也可能干扰与靶细胞膜融合所需的sEV的膜结构。因此，sEV的实际递送效率仍然需要测试。
miRNA在sEV中稀少，其绝对拷贝数范围从每106个sEV一份特定miRNA拷贝到每个sEV一份拷贝。这强调了任何使用sEV进行RNA治疗的尝试都可能需要将更多RNA包装到sEV中的方法。然而，sEVs装载了来自产生它们的细胞的高选择性RNA子集。例如，在sEVs中发现了在细胞中类似富集的特定miRNA，其相对量范围为106。这表明，仅仅过度表达miRNA可能无法使其包装到sEV中。序列基序可能不是最佳的解决方案，因为它们在sEVs中的富集不高，并且难以将siRNA插入。
Pre-miR-451是经典的pre-miRNA生物发生级联反应的一个例外。经Drosha处理后，pre-miR-451的茎环只有42 nt长，太短而无法被Dicer结合和切割。相反，pre-miR-451直接绑定到Ago2。Ago2裂解pre-miR-451茎环的远端链。这产生了一个34 nt的产物，该产物被核酸外切酶逐渐修饰，产生了大约21 nt的miRNA。值得注意的是，如果保留了pre-miR-451茎环的结构，则可以与其他miRNA序列重新编程，将通过相同的Dicer依赖性，Ago2依赖性途径将其加工成成熟的有效miRNA。
该研究证明了将siRNA整合到源自pre-miR-451的RNA主链中，而不是常规的pre-miRNA，可以将其牢固地包装到sEV中。以此方式包装有siRNA的sEV可以有效地减少培养物中以及小鼠中靶基因的表达。封装有siRNA的sEV可以以脂质纳米颗粒包装siRNA的十分之一的量敲低靶基因，这表明sEV是高效的运载工具。
通过pre-miRNA-451骨架加载到EV中的siRNA进行体内敲除
参考文献：
Reshke R, Taylor JA, Savard A, Guo H, Rhym LH, Kowalski PS, Trung MT, Campbell C, Little W, Anderson DG, Gibbings D. Reduction of the therapeutic dose of silencing RNA by packaging it in extracellular vesicles via a pre-microRNA backbone. Nature Biomedical Engineering. 2020 Jan;4(1):52-68. doi: 10.1038/s41551-019-0502-4. Epub 2020 Jan 14.
van Eijndhoven MAJ, Baglio SR, Pegtel DM. Packaging RNA drugs into extracellular vesicles. Nature Biomedical Engineering. 2020 Jan;4(1):6-8. doi: 10.1038/s41551-019-0514-0.
