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如何排除牛血清外泌体对外泌体样品的污染

细胞外囊泡是由细胞释放的纳米级膜包被囊泡,他们源于各种生理和病理状态的细胞,并在生理和病理状态下发挥着重要功能。细胞外囊泡(EV)主要包括外泌体(exosome)、微囊泡(MV)、凋亡小体等亚群。外泌体(直径30–150 nm)主要通过胞内体和多泡小体途径进行释放,而微囊泡(直径100–1000 nm)则主要通过从质膜脱落或出芽而从细胞上释放出来。凋亡小体则主要源于凋亡细胞后期的崩解,形成直径为50-5000 nm的细胞囊泡样碎片。

以外泌体为代表的细胞外囊泡是近些年研究的热点。由于技术限制,目前细胞外囊泡研究主要是利用体外培养细胞来源的囊泡,分析其在体内外的功能作用。而目前的细胞培养技术或多或少的用到了动物体液成分,无论是胎牛血清还是牛垂体提取物都不可避免的掺入了牛源的囊泡成分。先前的研究表明,直接使用常规的血清培养细胞会对细胞外囊泡研究产生可以预见的影响。

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血清源性细胞外囊泡直接影响细胞迁移
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血清源性细胞外囊泡残留影响外泌体成分分析(示意图)
目前市面上的商业化无外泌体血清主要是基于聚合物沉淀清除、超速离心或切向流过滤方式制备的无外泌体血清。此外,之前hzangs曾经撰写过相关的protocol,感兴趣的朋友可以关注往期推文:exosome-freeFBS的制备策略及使用技巧。研究报道愈发深入,针对无外泌体血清的制备工艺也产生了一定的分歧。对于研究者来说,相对容易实现的方法目前主要有两种策略:1、现将血清与培液按照1:4的比例稀释,然后超速离心10万g持续18小时;2、直接将纯血清超速离心10万g 持续18小时。外泌体研究领域的话事人Thery很推崇第1中方法,认为第2种方法并不能去除大部分牛源性细胞外囊泡,残留量较大,影响下游实验结论(详见MISEV2018)。而2020年有厦门大学颜晓梅教授使用由自己实验室研发的纳米流式细胞仪精确的分析了纯血清超离18小时后的囊泡残留量,并通过严谨的定量实验证实了纯血清超速离心10万g持续18小时可以去除约98%的外泌体等细胞外囊泡。由此可见,纯血清超速离心10万g持续18小时是目前可以被接受的策略。
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MISEV2018关于超离去除血清细胞外囊泡的描述
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纳米流式细胞仪定量分析超离后血清中的囊泡残留量(颜晓梅教授,JEV,2020)

综合以上的研究结果,目前对于研究者来说,最容易实现的策略就是纯血清10万g超离18小时,取上层80%的血清作为无外泌体血清用于后续的细胞培养。然而,这也是个浩大的工程!一次18小时的超速离心大约可以处理40 mL*6管的血清,取上层80%,产量也只有不到200 mL (192 mL)。操作不方便,机器磨损大,更有一些单位超速离心机严禁过夜使用,而商业化的无外泌体血清高达约2500元/ 50mL的售价又让普通研究者望而却步,这就导致很多细胞外囊泡研究者对于制备无外泌体血清一直很头痛!

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细胞克隆形成实验

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