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43分Nature子刊综述:细胞外囊泡在哺乳动物细胞中的RNA递送及其应用

​近日,哈佛大学和加州大学的研究人员在Nature ReviewsMolecular Cell Biology杂志上发表综述,系统介绍了细胞外囊泡RNA的生物发生、生物学功能和新兴的临床应用。

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细胞外囊泡是从原核和真核细胞释放的膜包裹的纳米级颗粒,携带蛋白质、脂质、RNA和DNA。它们可以通过细胞外空间在细胞之间传递信息,对受体细胞发挥作用。细胞外囊泡RNA包括多种类型,尽管含有小片段和完整的mRNA、核糖体RNA(rRNA)和长链非编码RNA(lncRNA),但小非编码RNA研究最多。大量证据表面细胞外囊泡中的RNAs影响摄取细胞的功能特性。例如,血浆中的细胞外囊泡可促进心肌细胞的修复,星形胶质细胞释放的囊泡可促进神经变性,而肿瘤衍生的囊泡可为癌症的进展和转移创造良好的微环境。

下表:细胞外囊泡功能性递送miRNA

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然而,鉴于许多非编码RNA(ncRNA)的功能尚不完全清楚,并且任何给定的细胞外囊泡相关RNA的传递都伴随着多种其他生物分子的传递,因此,细胞外囊泡介导的交流的复杂语言仍有待于进一步研究。此外,与细胞外RNA(exRNA)的运输和命运有关的细胞机制仍在研究中,包括将不同的RNA序列包装到不同类型的细胞外囊泡,特定受体细胞类型的不同摄取以及摄取后命运。

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细胞外囊泡RNA进行功能性细胞通讯的原理

细胞外囊泡中包含的RNA反映了源细胞的类型和生理/病理状态,但就RNA的类型和特定RNA序列的相对浓度而言,都与细胞RNA含量有很大不同。在生物流体、组织和培养细胞的条件培养基中的细胞外囊泡在大小、形态和组成方面是异质的。细胞外囊泡的四个主要亚类似乎来自不同的生物发生途径,并且可以根据大小进行大致区分:外泌体(50–150 nm),微囊泡(100–1,000 nm),大囊泡(1,000–10,000 nm)和凋亡体(100-5,000 nm),但很难与高密度和低密度脂蛋白、乳糜微粒、蛋白质聚集体和细胞碎片区分开来。相关术语、方法和报告标准化的指南正在制定,以提高整个研究的实验可重复性。大多数细胞外囊泡的大小使它们低于标准光学显微镜和荧光激活分选技术的分辨率和灵敏度阈值。不同细胞外囊泡亚类之间的大小和其他生物物理特性重叠,并且每个亚类都缺乏已知的独特标记,因此很难非常确切地确定不同亚类的货物(包括RNA)。技术因素,包括使用不同的方法分离细胞外囊泡及其RNA,可能会严重影响RNA分析结果。从与其他exRNA载体(包括脂蛋白和核糖核蛋白)相关的RNA分离出囊泡中的RNA也具有挑战性。已经采用了多种方法来解决这些问题,包括在无血清培养基中培养细胞(以避免血清来源的细胞外囊泡),以及通过高分辨率密度梯度离心分离细胞外囊泡亚类和其他exRNA载体,尺寸排阻色谱法,不对称流分离法和免疫亲和纯化。

除了充当细胞之间的新型通信方式外,细胞外囊泡中的RNA还可用作多种疾病的生物标记物和治疗剂。由于已经在所有测试过的生物流体中发现了细胞外囊泡,其中许多可以非侵入性收集,因此可以实时检测其中的RNA,以评估一系列细胞和组织类型的功能状态。细胞外囊泡可保护核酸和其他生物大分子免于体内降解,并有针对性地将其递送至受体细胞而不会激活免疫,这使它们成为一种令人兴奋的新形式,用于治疗RNA的递送,包括小的干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、反义寡核苷酸、mRNA、guide RNA和自扩增RNA。

这篇综述讨论了哺乳动物细胞胞外囊泡RNA的生物发生、生物学功能和新兴的临床应用。强调了关键的开放性问题和技术挑战,这些问题和挑战目前限制了细胞外囊泡的更广泛的转化应用。作者乐观地认为,这些障碍将很快克服,从而可以更好地了解和控制细胞外囊泡介导的将RNA传递至特定细胞靶标,并为检测和治疗各种疾病(包括心血管疾病、神经退行性疾病和代谢性疾病以及癌症)。

下表:细胞外囊泡和exRNA研究的挑战和局限性

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RNA包装到细胞外囊泡中并释放到细胞外空间

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细胞外囊泡RNA与受体细胞的相互作用及其功能传递

下表:细胞外囊泡追踪的方法

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使用细胞外囊泡进行治疗的不同策略。临床前评估或临床试验中细胞外囊泡治疗应用的例子。通常,可以使用五种策略:植入供体细胞,例如间充质干细胞(MSCs),其可在现场释放细胞外囊泡(1);从培养的供体细胞中注射纯化的、未修饰的细胞外囊泡(2);注射纯化的细胞外囊泡,这些囊泡经过修饰可用于体外靶向或装载货物(3);注射从基因修饰细胞来源的富含目标货物和/或增强的靶向/摄取特性的细胞外囊泡(4);植入可在体内释放出修饰的细胞外囊泡的转基因细胞(5)。

尽管人们普遍认为细胞外囊泡中的RNA介导细胞之间的通讯,并且已经展示了一种细胞类型的细胞外囊泡所携带的特定RNA的实例,这些细胞介导了对靶细胞的明确表型作用,但仍有许多问题需要解决来完全解读这种复杂的语言。存在各种类型的细胞外囊泡,其大小和蛋白质、脂质和RNA货物不同。迄今为止,已证明表征独特细胞外囊泡亚类的尝试具有挑战性,这在很大程度上是由于技术和生物学局限性以及这些纳米级结构的分离和分子分析相关的挑战。

此外,细胞外囊泡的RNA含量非常复杂,主要包含小的非编码RNA,其中大多数的功能才刚刚被阐明。越来越多的证据表明,不同的细胞外囊泡亚类携带不同的RNA货物,但是要对该货物进行全面分类,尚待开发出有效的方法来鉴定和分离细胞外囊泡亚类。有些细胞外囊泡可能含有更高含量的功能性RNA,而另一些则更多地充当了源细胞的“垃圾袋”(尽管如此,某些RNA的抛弃可能对源细胞和受体细胞都产生功能性后果)。就细胞外囊泡介导的信号传导而言,细胞外囊泡亚类“寻址”到不同受体细胞类型的方式有待描述。

尽管我们知道细胞外囊泡中的miRNA和mRNA可以转移至受体细胞并在受体细胞中发挥功能,但仍有待确定百分之几的RNA货物执行功能以及百分之几的丢失(或在受体细胞中根本不起作用)。这里的关键问题是细胞外囊泡中RNA的内体逃逸途径,因为这一步骤似乎是有效进行货物功能传递的主要瓶颈。考虑到细胞外囊泡在生理和疾病中的明显作用,了解这些问题对于深入了解致病机理和潜在的治疗干预至关重要。这篇综述提供了一个了解细胞外囊泡中运输的RNA的最新知识的平台,该领域可以在此平台上建立另一个层次的理解。同时,纳米颗粒迅速发展起来,可以有效地将mRNA和siRNA携带到细胞中并逃脱内体。将细胞外囊泡和纳米颗粒/脂质体领域进行对话,并结合两者的最佳特性,对于治疗应用而言至关重要。

参考文献:

O'BrienK, Breyne K, Ughetto S, Laurent LC, Breakefield XO. RNA delivery byextracellular vesicles in mammalian cells and its applicationsNatureReviews Molecular Cell Biology  43.3512020

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