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如果对外泌体纯度要求比较高怎么办?

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前些天给大家推荐的【史上最全细胞外囊泡研究方法综述】中提到超离和蔗糖梯度超速离心是目前分离外泌体的gold standard。超速离心是我们都知道的非常well-established protocol,也是CNS级别大paper都使用的分离外泌体的方法;蔗糖密度梯度超速离心(其实还有后来发展的碘克沙醇密度梯度离心)是在普通超速离心基础上建立的分离超高纯度外泌体的方法。

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虽然根据外泌体之家游虾的报道,外泌体大牛Thery在前几天的AACR年会上的超离+密度梯度离心得到的pellet是否可以称为exosomes表示了质疑,但是,目前并没有公认的比超离/密度梯度离心更严谨的外泌体提取/纯化方法。

所以,

如果你对外泌体的纯度要求高,可能依旧只能乖乖超离。

如果你对外泌体的纯度要求特别高,那就用密度梯度离心吧。

作为耀眼大paper分离外泌体的标准要求,为什么要用超离这里就不再赘述了。这里再给大家分析2件事情,当你要拿外泌体做蛋白或RNA成分分析时,你该用什么方法提取外泌体?

一、外泌体蛋白成分分析

做外泌体蛋白质谱分析,沉淀法容易产生杂蛋白污染,这一点是很多外泌体研究小伙伴们亲身经历过的。那么超离可以吧?超离一次也是不行的,要用PBS重悬再超离清洗一次,更有甚者PBS清洗2次。最好是能用密度梯度离心进行纯化。否则一堆的杂蛋白去做质谱,得出的结果完全没法做后续分析,而且投文章review那关也是过不掉的。

二、外泌体RNA成分分析

目前大多数研究者都在研究外泌体的RNA成分。做外泌体RNA成分分析(RNA-seq、芯片等)时,我们很多人都认为,做RNA分析嘛,蛋白污染不怕,又不是分析蛋白。其实不然。我们来看一张图,

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沉淀法或者仅普通超离一次得到的所谓的外泌体Pellet,其实包含着大量上图中所列的各类脂蛋白、乳糜、蛋白聚合物等。而这些蛋白成分是会携带RNAs

举个栗子,我们再来看2011年的一篇NCB文章,该研究主要介绍了miRNAs在血浆中通过高密度脂蛋白(HDL)递送至受体细胞。作者使用的什么方法提取的外泌体呢?是比沉淀法要严谨的超速离心!作者发现,miRNAs可以在in vitro和in vivo与HDL整合在一起,并通过HDL传递至靶细胞。然而,我们分离的外泌体中是混有HDL的,所以在分析外泌体RNA成分的时候,不用担心杂蛋白的污染或许是一个误导

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ApoA-I是HDL的marker;Exo是超离得到的外泌体;Exo-Exo是超离得到的外泌体经去除HDL步骤后得到的更加纯的外泌体;Exo-HDL是超离得到的外泌体中混杂的HDL;HDL指纯的HDL

那该怎么办呢?用密度梯度离心吧。毋庸置疑,密度梯度离心是目前分离外泌体最纯的方法。但是…细心的读者会发现,这个HDL的密度与外泌体的密度十分类似!囧。。。这或许就是开头咱们提到的大牛Thery对自己在2006年建立的方法(Curr Protoc Cell Biol, 2006)产生怀疑的原因之一吧。

说到这里,可能有些读者要抓狂了,连当前堪称gold standard能做的high purity的基于超速离心的密度梯度离心都不能做到完美,那该如何是好?囧。小编抛出这些问题主要是引发大家慎重思考,请各位不要恐慌,囧。如果采用了目前领域所能做到的最佳的方法了,那么投文章时review还能说什么呢。

上述几个例子是比较极端的情况,大多时候使用超速离心进行外泌体分离还是会得到reviewer的认可的。Anyway,这算是外泌体提取方法学的前沿了,襁褓中外泌体研究总归是要发展的。对于我们普通研究者而言,你只要知道,在外泌体纯度方面,密度梯度离心>普通超速离心>沉淀法。如果要投好杂志,普通超速离心已是标配,能用密度梯度离心最好了。而且,据小编小道消息,美帝很多实验室都开始把蔗糖垫超速离心作为标配了。

总之,根据自己期望发表的论文水平选择合适的外泌体提取方法。领域的要求越来越高,各位小伙伴的外泌体课题得抓紧了。

 

参考文献:

Shao, H., et al. (2018). "New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles." Chem Rev.

Simonsen, J. B. (2017). "What Are We Looking At? Extracellular Vesicles, Lipoproteins, or Both?" Circ Res 121(8): 920-922.

Vickers, K. C., et al. (2011). "MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins." Nat Cell Biol 13(4): 423-433.

Thery, C., et al. (2006). "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol Chapter 3: Unit 3 22.

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