miRNA与siRNA作为关键的基因调控分子，在疾病治疗中具有巨大潜力，但未经修饰的小RNA在体内稳定性差、易降解，并可能引发免疫反应，且细胞摄取效率有限，严重制约其临床应用。尽管病毒载体和脂质纳米颗粒在一定程度上提升了递送效率，但仍面临毒性、生物相容性不足及靶向性有限等问题。小细胞外囊泡（sEV）因其天然来源、低免疫原性和良好生物相容性，被认为是理想的RNA递送载体，但小RNA如何实现高效、稳定且可控地装载入sEV，仍是该领域亟待突破的关键瓶颈。蛋白N-肉豆蔻酰化（Myr）通过将肉豆蔻酸共价连接至蛋白N端甘氨酸，从而调控蛋白的膜定位及分子互作；已有研究证实来源于多种肉豆蔻酰化蛋白N端的短肽（Myr肽）能够显著促进蛋白类货物进入sEV。然而，这一策略是否同样适用于小RNA的装载，以及其分子基础，一直缺乏系统研究。
近期，中山大学附属第八医院伍贵富教授、附属第一医院范文冬副研究员团队在Bioactive Materials杂志上发表题为“Robust loading and delivery of functional small RNAs via protein N-myristoylation-induced small extracellular vesicles.“的研究论文，主要介绍了基于蛋白N-肉豆蔻酰化（Myr）的sEV装载系统PMEVL。该系统将小RNA表达盒插入Myr短肽基因3′UTR区域，通过激活ERK1/2通路、抑制AMPK-自噬轴提高sEV生成量，同时招募ANXA2、AGO2及ESCRT家族组分，实现小RNA高效装载，且可兼容多种类型RNA及蛋白的共装载。论文的共同第一作者为王慧杰、章小哲、梁韵军和曾泽楷；通讯作者为范文冬、伍贵富。
- PMEVL系统促进外源合成小RNA向sEV的装载
为验证Myr肽介导小RNA装载至sEV的可行性，该研究选取CHMP6来源的Myr肽（Myr(CHMP6)）作为典型N-肉豆蔻酰化肽段，考察其对外源化学合成siRNA、miRNA的装载能力。为便于可视化观察与定量分析，构建由mCherry荧光蛋白、NanoLuc荧光素酶及3×FLAG标签组成的Myr-CNF融合报告蛋白。
将外源合成的目标小RNA（siRNA-METTL3或let-7i-5p miRNA），与Myr-CNF质粒或对照CNF质粒共转染至lenti-X 293T细胞，采用RT-qPCR技术检测细胞裂解液、细胞上清液中目标RNA的表达水平，结果显示Myr-CNF转染组细胞上清液中目标RNA的富集程度显著提高，初步证实该系统可实现外源小RNA的高效胞外富集。接着采用超速离心法分离sEV，通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析及Western blot技术对其进行表征，结果显示两组sEV均呈现典型的杯状形态（sEV标志性特征），尺寸分布峰值分别为122 nm（对照组）和134 nm（Myr-CNF组），说明Myr肽对sEV的尺寸影响较小。Myr-CNF转染组的sEV产量显著高于对照组，且sEV中带有FLAG标记的Myr-CNF蛋白表达量明显升高，证实Myr肽能够增强蛋白向sEV的装载效率。Western blot检测显示，sEV特异性标志物CD81、ALIX在分离样品中显著富集，而内质网标志物Calnexin未被检测到，表明所分离的sEV纯度较高，无细胞碎片污染。此外，Myr-CNF转染可显著提高sEV中目标RNA的富集水平，其中siRNA-METTL3的富集倍数约为60倍，let-7i-5p的富集倍数约为15倍，证实PMEVL系统可高效实现外源合成小RNA向sEV的装载（图1）。
图1：PMEVL实现外源小RNA高效装载入sEV
A，外源siRNA/miRNA装载流程示意；B–C，上清中siRNA-METTL3与let-7i-5p富集显著提升；D，sEV典型电镜形态；E–G，NTA显示粒径分布及sEV合成增加；H，Myr-CNF提高蛋白装载效率（FLAG）且sEV标志物（CD81、ALIX）富集；I–J，sEV中小RNA富集显著增强。
- PMEVL平台增强内源性miRNA向sEV的封装
内源性miRNA同样具有重要治疗价值，研究进一步评估PMEVL系统促进内源性miRNA封装至sEV的能力。设计双功能共表达载体，该载体包含由CMV启动子驱动的Myr-CNF/CNF（对照）表达单元，以及位于转录本3′UTR区域的miRNA表达元件，可特异性产生miR-200a-3p、miR-125b-5p、miR-451三种目标miRNA。将上述载体分别转染至细胞后，采用RT-qPCR技术定量检测细胞裂解液、细胞上清液及sEV中目标miRNA的表达水平。结果显示，Myr-CNF转染组细胞上清液中三种miRNA均出现显著富集，且在sEV中的富集效应更为明显，其中miR-200a-3p的富集倍数约为1616倍、miR-125b-5p约为162倍、miR-451约为12倍，证实PMEVL系统可高效实现内源性miRNA向sEV的装载。
为拓展PMEVL系统的适用范围，进一步评估其装载长链RNA（GFP mRNA、mCherry mRNA）的能力。结果显示，转染Myr-CNF后，sEV中GFP mRNA的富集倍数约为278倍，mCherry mRNA的富集倍数约为16倍，说明PMEVL系统可装载多种类型、不同长度的RNA，具有良好的通用性。
- N-肉豆蔻酰化介导miRNA的高效特异性装载与递送
由于PMEVL系统对miR-200a-3p的装载效率最高，研究以miR-200a-3p为模型货物，深入探究N-肉豆蔻酰化依赖的装载与递送机制。将Myr-CNF与miR-200a-3p共表达后，sEV中miR-200a-3p的富集水平显著高于对照组，而细胞内高丰度的非货物RNA（let-7i-5p、GAPDH mRNA）在sEV中的富集水平极低，证实PMEVL系统具有极强的货物特异性，能够精准装载目标RNA。
为验证miR-200a-3p被成功装载至sEV内部，采用高分辨率碘克沙醇密度梯度离心法分离sEV，结果显示miR-200a-3p的分布峰与sEV标志物CD81、ALIX的分布峰完全重合，证实miR-200a-3p被特异性装载至sEV内部。RNase保护实验进一步确认，单独采用RNase A处理（可降解囊泡表面的游离RNA）时，miR-200a-3p的表达水平未受影响；而先用Triton X-100预处理（破坏sEV膜结构）后再用RNase A处理，miR-200a-3p的表达水平显著下降，表明sEV膜能够保护腔内的RNA免受外界RNase的降解，为其体内递送提供保障。
为验证N-肉豆蔻酰化对PMEVL系统功能的必要性，在Myr肽的第2位引入G2A突变（该突变可消除N-肉豆蔻酰化修饰）。CCK-8检测结果证实，功能性Myr肽、Myr(G2A)突变体的表达均不会影响细胞活力。关键实验结果显示，Myr(G2A)突变体完全丧失了增强sEV生成及miR-200a-3p装载的能力，其装载效率与对照组无显著差异，证实N-肉豆蔻酰化是PMEVL系统实现miRNA稳健、特异性装载的核心前提（图3）。
为评估PMEVL系统的功能性递送能力，开展体外摄取实验，选取HUVEC细胞作为受体细胞（团队此前在该细胞中证实KEAP1是miR-200a-3p的功能性靶点）。共聚焦显微镜观察结果显示，经PKH67标记的sEV与HUVEC细胞共培养24小时后，成功被细胞摄取；Western blot检测证实，PMEVL工程化sEV可显著抑制HUVEC细胞中KEAP1蛋白的表达，证实该系统可实现N-肉豆蔻酰化依赖的miRNA高效特异性装载与功能性递送（图3）。
图3：蛋白N-肉豆蔻酰化介导功能miRNA的高效特异装载与递送
A，miR-200a-3p特异性富集（非货物RNA不富集）；B，密度梯度离心显示miRNA与sEV标志物共分布；C–D，RNase保护实验证明RNA被囊泡包裹；E，Myr与G2A突变构建示意；F，细胞活力无影响；G–H，G2A突变消除sEV生成与RNA装载增强效应；I–J，sEV递送miRNA后下调HUVEC中KEAP1蛋白。
- 基于pri-miRNA骨架实现内源性siRNA的生成与递送
在证实PMEVL系统可装载内源性miRNA后，本研究进一步探索其装载内源性siRNA的潜力。pri-miRNA（初级miRNA）是成熟miRNA的前体，常被用作细胞内siRNA的合成支架；与传统shRNA相比，插入pri-miRNA骨架的人工miRNA（AmiRNA）具有更高的沉默特异性和效率，且脱靶效应更低，因此选用pri-miRNA骨架作为内源性siRNA的表达载体。
为筛选最优的pri-miRNA支架，评估了pri-miR-30a、pri-let7b、pri-miR-92a、pri-miR-23a四种支架（其产生的miRNA在sEV中具有天然富集特性），并对每种支架进行改造：在其颈环结构的3′端嵌入siRNA-METTL3序列，在5′端嵌入互补链并添加UC序列，以确保siRNA能够正确折叠并被细胞加工机制识别。将改造后的支架与Myr-CNF共表达于lenti-X 293T细胞，RT-qPCR检测结果显示，pri-miR-30a支架组细胞裂解液、细胞上清液中siRNA-METTL3的表达水平显著高于其他支架；功能验证结果显示，该支架介导的METTL3沉默效率也最优，因此确定pri-miR-30a为后续siRNA表达的最优支架。
将lenti-X 293T细胞分别转染Myr-pri-miR-30a-siMETTL3、pri-miR-30a-siMETTL3或对照载体，分离得到的sEV分别命名为Myr-siMETTL3-sEV、siMETTL3-sEV、control-sEV。将三种sEV与HUVEC细胞共培养后，Western blot检测显示，Myr-siMETTL3-sEV组HUVEC细胞中METTL3蛋白的表达水平显著降低，表明pri-miR-30a支架可高效生成功能性siRNA，PMEVL系统可通过sEV将其递送至受体细胞，实现靶基因的强效沉默（图4）。
- PMEVL系统实现多siRNA的同时装载
多数疾病的发生发展与多基因异常调控相关，同时调控多个靶标对于提高治疗效果、减少不良反应具有重要意义。基于此，该研究测试了PMEVL系统能否装载基于pri‑miR‑30a骨架的多种siRNA，以实现多靶点协同调控。
该研究选取靶向YAP、EZH2、METTL3的三种已知siRNA，将其分别插入pri‑miR‑30a骨架，并置于Myr‑CNF或对照CNF的3′UTR区域，构建单siRNA表达载体。RT‑qPCR检测结果显示，与对照组相比，Myr‑CNF共表达组细胞上清液中三种siRNA的富集倍数均显著提高。接着，分离sEV并定量其中RNA水平，结果与细胞上清液一致：Myr‑CNF过表达可使sEV中三种siRNA显著富集，其中siYAP的富集倍数约为108倍、siEZH2约为25倍、siMETTL3约为419倍，证实PMEVL系统可装载多种基于pri‑miR‑30a骨架的siRNA进入sEV（图5）。
构建两种串联载体：Myr‑siYEM（在Myr‑CNF下游串联三种siRNA表达元件）与siYEM（在对照CNF下游串联相同的siRNA表达元件）。采用慢病毒将两种载体转导至HUVEC细胞后，Western blot检测证实，pre‑miR‑30a骨架可同时合成三种功能性siRNA，并显著降低YAP、EZH2、METTL3蛋白的表达水平；同时，Myr‑CNF可使三种siRNA高效释放至细胞上清液，并以与单siRNA装载相当的水平进入sEV，证实PMEVL系统可实现多siRNA的同时装载，为多靶点基因治疗提供了可行的技术方案（图5）。
图5：PMEVL支持多siRNA协同装载
A，siRNA装载策略示意；B–D，上清中siYAP、siEZH2、siMETTL3显著富集；E–G，sEV中对应siRNA进一步富集；H，多顺反子siRNA表达载体设计；I–J，实现同时抑制YAP、EZH2、METTL3蛋白；K–L，验证多siRNA在上清及sEV中的高效装载（与单siRNA相当的水平）。
- PMEVL系统的分子调控机制
阐明PMEVL系统介导小RNA装载的分子机制，是其实现临床转化的关键。该研究以Myr肽为诱饵，采用TurboID邻近标记技术，鉴定出1455种与Myr肽相互作用的邻近蛋白。生物信息学富集分析结果显示，这些蛋白主要参与多囊泡体（MVB）组装、膜分裂、外泌体分泌等sEV生物发生的关键过程，与Myr肽的功能高度匹配；通路分析结果提示，Myr肽可能通过调控内吞、ERK1/2、AMPK等通路参与sEV的合成与RNA装载。实验验证结果显示，Myr肽可显著上调p‑ERK1/2的表达水平（即激活ERK1/2通路），同时下调p‑AMPK、LC3‑II的表达水平，上调p62的表达水平（即抑制AMPK通路与自噬过程）。采用SCH772984抑制ERK1/2通路、AICAR激活AMPK通路后，均显著减弱了Myr肽诱导的sEV生成及货物（NLUC蛋白、miR‑200a‑3p）装载效果，证实Myr肽通过激活ERK1/2通路、抑制AMPK-自噬轴，协同促进sEV的生成。
在1455种邻近蛋白中，包含598种RNA结合蛋白，其中包括miRNA递送介导因子ANXA2及ESCRT系统关键蛋白ALIX、TSG101（ESCRT系统在MVB形成、sEV分选过程中发挥核心作用，ANXA2参与miRNA的胞内转运）。亲和纯化实验证实，Myr肽可与ANXA2、ALIX、TSG101蛋白发生直接相互作用，而Myr(G2A)突变可完全消除这种相互作用，说明N-肉豆蔻酰化是Myr肽与这些蛋白结合的前提条件。siRNA敲低实验显示，沉默ANXA2、ALIX、TSG101中任意一种蛋白的表达，均会显著削弱Myr肽促进miR‑200a‑3p装载的能力。进一步分析发现，沉默ANXA2仅会损害miRNA的装载过程，不会影响sEV的产量；而沉默ALIX、TSG101则会同时降低sEV的产量与miRNA的装载效率，表明ANXA2在miRNA的分选过程中发挥独特作用，而ALIX、TSG101则通过参与sEV的生物发生，广泛调控RNA-蛋白复合物向MVB的分选（图6）。
图6：PMEVL通过激活ERK1/2、抑制AMPK-自噬增强sEV合成，并招募ANXA2和ESCRT关键蛋白来促进RNA装载
A，TurboID邻近标记与质谱分析流程；B–C，Myr激活ERK1/2、抑制AMPK-自噬（p62↑、LC3-II↓）；D–E，药物干预验证通路依赖性（Western blot确认药物干预有效逆转Myr肽对ERK1/2及AMPK通路的调控）；F，药物干预证实ERK激活/AMPK抑制促进sEV生成；G，药物干预评估对蛋白货物装载的影响；H，药物干预评估对小RNA货物装载的影响；I，Myr短肽与ANXA2、ALIX、TSG101、AGO2蛋白的相互作用；J，敲低上述蛋白削弱RNA装载。
综上，PMEVL通过双重机制调控sEV合成与RNA装载：①激活ERK1/2、抑制AMPK-自噬轴，促进sEV分泌；②招募ANXA2及AGO2介导miRNA装载，招募ESCRT机器（ALIX/TSG101）介导复合物分选（图6）。
- PMEVL系统的体内外功能验证（以Pcsk9为靶标）
为评估PMEVL系统的临床应用潜力，研究以Pcsk9（一种肝脏分泌蛋白，可通过降解LDLR升高血浆LDL-C水平，是高脂血症等心血管疾病的关键治疗靶点）为靶标，开展体内外功能验证实验，构建了装载小鼠Pcsk9靶向siRNA（siPcsk9）的PMEVL系统。体外实验结果显示，Myr-CNF可高效、特异性地将siPcsk9装载至sEV中，且不影响非目标RNA（let-7i-5p、GAPDH mRNA）的分选；密度梯度离心与RNase保护实验证实，siPcsk9被成功封装于sEV内部，且其装载过程依赖N-肉豆蔻酰化修饰。功能验证结果显示，PMEVL工程化sEV可被Hepa1-6肝细胞高效摄取，并显著抑制该细胞中Pcsk9蛋白的表达，证实该系统在体外具有高效的递送能力与基因沉默效果（图7）。
体内荧光示踪实验显示，将PMEVL工程化sEV通过尾静脉注射后，其主要在小鼠的肝脏组织中富集，24小时达到富集峰值，且富集效果可持续3天，这为靶向肝脏Pcsk9的治疗奠定了基础。C57BL/6小鼠体内治疗实验显示，与对照组相比，注射siPcsk9-sEV的小鼠肝脏组织中Pcsk9蛋白的表达水平显著降低，LDLR的表达水平显著恢复，血清中LDL-C、总胆固醇的含量显著下降，而甘油三酯的含量无明显变化，表明该系统可特异性调控血脂代谢过程。此外，安全性评估结果显示，注射siPcsk9-sEV的小鼠血清中ALT、AST的水平与对照组无显著差异，肝脏组织未出现明显异常，证实该系统具有良好的安全性（图8）。
- 系统性筛选人源Myr肽优化PMEVL系统
为进一步提高PMEVL系统的装载效率，研究探索了除Myr(CHMP6)外的人源Myr肽作为装载元件的可能性，提出假设：转染后在sEV中积累量高于Myr(CHMP6)的人源Myr肽，其介导RNA装载的效率可能更优。本研究筛选了181种含有UniProt注释N‑肉豆蔻酰化位点的人源候选肽段，为每种肽段构建了“15–18个氨基酸的Myr肽+C端CNF报告标签”的融合蛋白（CNF用于肽段的示踪与荧光素酶定量）。将融合蛋白质粒转染至细胞后，通过荧光素酶活性定量检测细胞裂解液、细胞上清液中货物蛋白的水平，以“胞外/胞内荧光信号比值（E/I）”作为装载效率的评价指标，实验结果显示，有16种肽段的装载能力显著高于Myr(CHMP6)，19种肽段的装载能力与Myr(CHMP6)相当。
进一步选取装载效率排名前五的肽段（FRS3、FGR、CABP1（L亚型）、FYN、RNF11），将其与基于pri‑miR‑30a骨架的si‑Pcsk9表达元件共表达，评估其蛋白与RNA双货物的装载能力。结果显示，这五种肽段在装载CNF蛋白与si‑Pcsk9 RNA方面的效率均优于Myr(CHMP6)，具体表现为更高的E/I比值与sEV中货物RNA的表达水平，且这些优化肽段的表达不会影响细胞活力，生物相容性良好（图9）。
图9：筛选人源Myr肽优化PMEVL装载效率
A，NanoLuc筛选流程；B–C，181种Myr肽装载能力比较；D，筛选出的TOP 5候选Myr肽，显著提升NanoLuc蛋白递送效率（E/I比值升高）；E，提高siRNA在sEV中的装载效率；F，对细胞活力无明显影响。
接着，以miR‑200a‑3p（富集倍数最高的RNA货物）为目标，对单个sEV中miRNA的拷贝数进行绝对定量：利用合成的miR‑200a‑3p绘制标准曲线，结合RT-qPCR检测的总拷贝数与NTA测定的总sEV颗粒数，计算单个sEV中miRNA的拷贝数。实验结果显示，miR‑200a‑3p的装载量随Myr肽的不同存在显著差异：Myr(CHMP6)的装载量约为0.43拷贝/sEV，FYN约为0.89拷贝/sEV，FGR约为1.05拷贝/sEV，证实优化后的人源Myr肽可提高单个sEV的RNA递送能力（图9）。
- PMEVL系统的优势与不足
（一）优势
①模块化结构具备灵活性：PMEVL系统采用模块化设计，通过替换pri-miRNA骨架中的siRNA表达框，可生成多种不同的siRNA或实现多siRNA共表达；替换蛋白模块则可实现多RNA/蛋白的联合递送，能够根据不同疾病的治疗需求进行定制化设计。
②临床转化潜力显著：PMEVL系统可提高sEV的分泌量与货物装载效率，减少对大规模细胞培养的依赖，降低生产成本，为该系统的工业化生产与临床转化奠定了良好基础。
③生物安全性良好：该系统采用人源内源性Myr短肽，可避免外源性载体引发的免疫排斥反应；小鼠全身给药实验未观察到明显的肝毒性或组织损伤，尽管长期安全性仍需进一步验证，但整体临床应用前景良好。
（二）不足
①大规模分离纯化存在挑战：与所有sEV递送平台类似，如何优化大规模sEV的分离工艺、实现高纯度、高产量sEV的高效分离，是PMEVL系统实现临床转化的重要瓶颈，后续需开发更高效、低成本的分离技术。
②组织靶向性有待提升：目前PMEVL工程化sEV主要在肝脏组织中富集，肝外组织的递送效率较低，这限制了其在非肝脏疾病治疗中的应用，后续需通过改造sEV实现肝外组织的靶向递送。
③货物适用性需进一步验证：PMEVL系统对不同类型RNA/蛋白货物的递送效率存在较大差异，其通用性仍需进一步验证，后续需扩大货物测试范围，全面评估其装载效率。
综上，该研究构建的PMEVL系统，通过N-肉豆蔻酰化介导的双重机制，实现了小RNA的高效、稳定、可重复装载，经人源Myr肽筛选优化后，其装载效率得到进一步提升。体内外功能验证实验证实，该系统具有良好的治疗潜力与生物安全性，为小RNA的临床递送提供了全新的策略。
参考文献：
Robust loading and delivery of functional small RNAs via protein N-myristoylation-induced small extracellular vesicles. Bioactive Materials. 2026 63: 422-438. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2026.04.012
原文链接: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X26002148
外泌体资讯网 Bioactive Materials｜中山大学附属第八医院伍贵富、附属第一医院范文冬团队：开发新型PMEVL平台，突破小RNA细胞外囊泡递送瓶颈
