外泌体（Exosomes）是细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到外基质中的膜性囊泡。因其纳米级尺寸效应与承继来源细胞生物学功能的特性，在神经退行性疾病、肿瘤和心脑血管疾病等重大疾病的诊疗方面已展现出巨大的潜力。然而，外泌体功能化修饰面临制备效率低、膜蛋白失活、膜结构破坏等局限，特别是对于非可传代培养细胞（如NEs）来源外泌体的规模化制备尚无合适方法，这使得外泌体在临床转化过程中仍面临着严峻挑战。因此，进一步探索外泌体功能化修饰与规模化制备技术是当前亟待解决的关键问题。
近日，重庆大学医学院王亚洲教授与生物工程学院尹铁英教授团队在PNAS（美国科学院院刊）以长文在线发表了题为“Hybridoma-inspired strategy crafts tailored multifunctional exosomes for precision therapy”的研究论文。该研究通过构建间充质干细胞（MSCs）与中性粒细胞（NEs）杂交细胞，证实了MSCs-NEs杂交细胞（HCs）兼具MSCs 与NEs 的生物学特性，且其外泌体H/Exos承继了NEs 快速炎症响应与MSCs 组织修复特性；经多次传代培养后，HCs及其外泌体表型仍能维持稳定。论文的第一作者为重庆大学2021级博士生董铸峰，医学院王亚洲教授为论文的通讯作者，生物工程学院尹铁英教授为论文共同第一作者和共同通讯作者，重庆大学为论文第一单位和唯一通讯单位。
作者在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）动物模型中揭示了H/Exos能够高效跨血脑屏障（BBB）并精准快速炎症响应，同时通过调控小胶质细胞表型，高效清除淀粉样蛋白、修复受损神经元，从而显著改善学习和认知功能（图1）
。该研究提出的杂交细胞工程化外泌体，不仅为个性化、模块化、多功能外泌体的工程定制开辟了新的道路，还可实现基于不同疾病类型、不同病患个体的个性化杂交细胞组合，同时为非可传代培养细胞来源外泌体的规模化制备提供了新的策略。
图1. MSCs-NEs杂交细胞制备及其外泌体H/Exos精准治疗阿尔茨海默病的示意图
作者通过聚乙二醇1500（PEG 1500）作为细胞融合诱导剂，成功实现了间充质干细胞（MSCs）与中性粒细胞（NEs）的融合，构建出新型杂交细胞HCs（图2A，B）。流式细胞术分析表明，HCs同时表达MSCs和NEs的特征表面标志物，证实其杂交表型的成功建立（图2C）。转录组测序结果进一步揭示，HCs在基因表达层面上兼具两种亲本细胞的特点：不仅保留与神经修复、胶质细胞分化、神经突触发育以及免疫调节等相关功能基因的表达，还表现出独特的基因表达谱（图1D）。Western blot（WB）实验也从蛋白水平验证了上述表型的稳定性，表明HCs在体外增殖过程中能够良好维持双亲本细胞的生物学特征（图2E，F）。研究发现，HCs表达更高水平的黏附因子配体VLA-4和LFA-1，以及趋化因子受体CXCR2，这表明HCs具有潜在的炎症环境靶向的能力。
在此基础上，研究团队进一步从HCs的培养上清中分离提取外泌体（H/Exos），并以MSCs来源外泌体（M/Exos）和Nes来源外泌体（N/Exos）作为对照，系统评价其理化及生物学特性（图2G-I）。通过WB、SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和miRNA测序分析，发现H/Exos携带了与M/Exos和N/Exos一致的蛋白组成，提示其承继了双亲本外泌体的物质基础（图2J-K）。在功能实验中，体外BBB模型验证了H/Exos具有优异的跨越BBB的能力，且该过程依赖于其表达的LFA-1分子与脑血管内皮细胞上相应受体的相互作用（图2L-M）。更重要的是，在炎症刺激条件下，H/Exos表现出比对照外泌体更高的BBB穿透效率和炎症靶向特异性，凸显其在炎症相关神经系统疾病治疗中的应用潜力。
图 2. 杂交细胞HCs及其外泌体H/Exos兼具MSCs和NEs的生物学功能
作者分别在APP/PS1转基因AD小鼠模型和Aβ1-42诱导的AD模型中深入验证了H/Exos具有高效的BBB穿透能力，还能特异性富集于AD病变微环境。通过莫里斯水迷宫和Y迷宫行为学评估，发现H/Exos治疗能够显著改善APP/PS1转基因小鼠的学习与记忆能力（图3A-D）。脑组织冰冻切片与免疫组化分析发现H/Exos能够显著减少Aβ斑块面积（图3E），并显著促进神经可塑性相关蛋白（Gap43和NEFL）和突触蛋白SNAP的表达（图3F-H）。这些结果在体外冈田酸（OA）神经元损伤模型中也得到验证，表明H/Exos能够有效促进神经突触和轴突的修复（图3I）。
图 3. 杂交细胞外泌体修复神经元损伤改善APP/PS1小鼠认知功能
通过单细胞测序分析（scRNA-seq）发现在经H/Exos治疗后，小鼠脑组织细胞中小胶质细胞数量显著增加，且H/Exos能够促进CD45⁺细胞与吞噬功能增强、炎症抑制和神经修复相关基因的表达。相较于对照组，H/Exos处理显著抑制了Aβ生成及与其沉积相关蛋白基因的表达，如APP、Psen1、Bace1、Clu和Ttr等。这些结果表明，H/Exos可能通过协同调控小胶质细胞功能、抑制神经炎症及减少Aβ沉积等多方面改善AD病理进程，从而促进认知功能恢复。
在对脑组织中的小胶质细胞进行更为深入的高分辨率聚类分析后，研究团队鉴定出了14个功能各异的亚群（图4A-F）。这些亚群包括6类稳态小胶质细胞（HM1–6，对应簇0–5）、3类疾病相关小胶质细胞（DAM，对应簇8–10），以及MHC II⁺小胶质细胞（簇13）、IFN-R⁺小胶质细胞（簇11）、增殖型小胶质细胞（簇12）和2类过渡态小胶质细胞（TM1–2，对应簇6–7）。转录组功能富集分析表明，经H/Exos干预后，IL-1β的表达在小胶质细胞中显著抑制，而与吞噬作用、内吞过程和溶酶体降解相关的基因表达则明显上调，表明H/Exos可有效重塑小胶质细胞表型，使小胶质细胞从促炎状态向修复和清除功能的表型转换。高分辨率免疫荧光成像进一步揭示了小胶质细胞的空间形态差异（图4G-I）：吞噬Aβ斑块的小胶质细胞通常表现出胞体增大、分支变粗且二级分支数目减少的“活化”形态；而远离斑块的小胶质细胞则多呈典型的“阿米巴”形态，提示其处于静息或迁移状态。定量分析显示，H/Exos治疗显著提高了具有吞噬形态的小胶质细胞在斑块周围的分布比例，并显著促进了这些细胞向Aβ沉积区域的迁移和包裹。此外，代谢通路分析结果还表明（图4J-K），H/Exos可增强小胶质细胞中鞘磷脂代谢相关酶的表达，从而改善其膜稳定性与吞噬功能，这可能是其促进Aβ清除的重要机制。
图 4. 杂交细胞外泌体能够抑制神经炎症，并促进小胶质细胞的吞噬表型清除Aβ
该研究受杂交细胞技术启发，将具有组织修复和免疫调节功能的MSCs与快速炎症响应的NEs进行融合，成功构建了能够在增殖过程中稳定分泌兼具双亲本细胞特性外泌体的杂交细胞HCs，为外泌体，特别是非可传代细胞来源外泌体的工程化修饰和规模化制备提供了新的策略。该方法制备的工程化外泌体在AD动物模型中证实了其能够特异性靶向AD病变微环境，并通过调控小胶质细胞表型转化，显著抑制神经炎症反应并增强Aβ清除能力；以及修复溶酶体功能、改善线粒体稳态及神经元突触可塑性等多重功能来改善AD模型小鼠的认知功能。
参考文献：
Hybridoma-inspired strategy crafts tailored multifunctional exosomes for precision therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 122 (37) e2424547122.
原文链接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2424547122
