血友病患者因反复关节出血，常发展为血友病性关节病（hemophilic arthropathy, HA），这是一种严重影响活动能力和生活质量的退行性关节疾病。虽然预防性凝血因子替代治疗可显著降低出血风险，但突破性出血及抑制物的产生仍使许多患者发生关节损伤。过去常用的旁路制剂包括重组活化凝血因子VII（rFVIIa）和活化凝血酶原复合物。近年来，双特异性抗体等新型治疗手段虽改善了止血效果，但仍不能完全避免突破性出血。
关节出血可诱发滑膜炎症，而炎症被认为在HA发生发展中起关键作用，因此抗炎治疗成为潜在策略。已有研究表明，通过阻断iRhom2/ADAM17/TNF-α通路或联合IL-6受体阻断抗体，可减轻小鼠模型中的滑膜炎和软骨损伤。此前的研究发现，FVIIa结合内皮细胞蛋白C受体（EPCR）后可激活PAR1信号，产生抗炎和血管保护作用，并诱导内皮细胞释放外泌体（eEVs）。进一步研究表明，FVIIa释放的eEVs富含抗炎性microRNA，尤其是miR-10a，能转移至单核细胞和初始内皮细胞，发挥抗炎和屏障保护作用。
该研究利用F8-/-小鼠建立HA模型（针刺膝关节囊诱导大量关节出血），探讨了FVIIa释放的eEVs及其中miR-10a的作用。结果显示，注射FVIIa-eEVs显著抑制了出血诱导的HA。将miR-10a抑制剂装载入FVIIa-eEVs可逆转其保护作用，提示该效应依赖于eEVs中的miR-10a。进一步实验发现，将miR-10a模拟物装载至对照eEVs亦可赋予保护效果。无论是FVIIa-eEVs还是携带miR-10a模拟物的eEVs，均能明显降低出血后滑膜中IL-6表达和血管渗漏。值得注意的是，这些处理对血友病小鼠的延长出血时间无显著影响。
注射FVIIa释放的eEVs可减轻F8-/-小鼠针刺关节出血后的关节肿胀和出血评分
本研究在血友病小鼠（F8-/-）关节出血模型中系统评估了FVIIa释放的eEVs的保护作用。结果显示，与生理盐水或对照eEVs相比，FVIIa-eEVs处理显著减轻了针刺诱导的膝关节肿胀，关节直径在伤后第2–4天仅增加约30%，且第14天完全恢复正常；而对照组小鼠至第14天仍有明显肿胀。视觉出血评分（VBS）在伤后第2天三组均升高，但FVIIa-eEVs组自第4天起明显下降，并在第12天完全消失，对照组则持续偏高。肉眼及组织学检查进一步证实，FVIIa-eEVs组软组织无明显褐色沉积，铁染色显示铁沉积极少，而对照组关节内仍有残留血液及显著铁沉积。延迟给药实验表明，若FVIIa-eEVs在伤后24小时开始使用，其保护效果有所推迟但在第12天仍完全恢复；若在伤后4天起始给药，保护作用减弱，但仍能在第10天后显著降低关节肿胀和VBS。总体结果表明，FVIIa-eEVs在血友病关节出血后的早期干预中可有效减轻关节损伤，其作用部分依赖给药时机。
FVIIa释放的eEVs治疗可减轻关节出血诱导的滑膜炎和血友病性关节病
研究发现，F8-/-小鼠关节出血后若接受生理盐水或对照eEVs，表现为明显的滑膜增生、巨噬细胞浸润、血管新生以及软骨蛋白多糖严重丢失，部分区域甚至出现全层软骨缺失。相反，接受FVIIa-eEVs治疗的小鼠滑膜增生和红细胞外渗极少，滑膜结构清晰，巨噬细胞浸润和血管新生显著减少，关节软骨大体保持完整，无明显退变。组织学评分显示，FVIIa-eEVs组滑膜炎评分（2.87±0.85）显著低于生理盐水组（10.67±0.21）和对照eEVs组（10.57±0.20），提示其有效保护关节免受出血诱导的炎症和退行性损伤。
FVIIa释放的eEVs中miR10a在减轻血友病性关节病中的关键作用
研究首先将miR10a抑制剂装载入FVIIa-eEVs。结果显示，加入miR10a抑制剂完全逆转了FVIIa-eEVs在减轻关节肿胀和视觉出血评分（VBS）方面的保护作用，关节组织出现褐色沉积、红细胞外渗、滑膜增生、巨噬细胞浸润和血管新生，与生理盐水组相似；而装载乱序miR10a的FVIIa-eEVs仍保持保护效果，滑膜炎评分显著较低（4.37±0.75 vs 9.7±0.36）。
进一步实验表明，将miR10a模拟物装载入对照eEVs后可显著降低关节肿胀和VBS，且关节外观与未损伤膝关节相似，铁沉积明显减少。组织学和免疫组化结果证实，miR10a模拟物处理组滑膜增生、巨噬细胞浸润、血管新生和软骨退变均显著减轻，滑膜炎评分（4.81±0.87）显著低于生理盐水组和对照eEVs组（约10分）。
eEVs中miR10a可减少关节出血诱导的软骨细胞凋亡并抑制IL-6表达与血管渗漏
TUNEL染色结果显示，F8-/-小鼠针刺关节出血后软骨细胞凋亡显著增加（约52±4个/视野）。FVIIa释放的eEVs可明显降低凋亡水平（17±4个/视野），但加入miR10a抑制剂则完全丧失保护作用。对照eEVs无明显效果，而装载miR10a模拟物的对照eEVs可显著减少凋亡（19±1个/视野）。
进一步检测发现，关节出血使滑膜IL-6水平显著升高（26.2±2.0 ng/ml），生理盐水或对照eEVs未能改善。FVIIa-eEVs几乎完全阻断IL-6表达（1.6±0.06 ng/ml），但加入miR10a抑制剂则失效。对照eEVs携带miR10a模拟物同样显著降低IL-6水平（1.8±0.22 ng/ml）。血管通透性实验表明，关节出血显著增加血管渗漏，而FVIIa-eEVs或携带miR10a模拟物的对照eEVs均能有效减少渗漏；加入miR10a抑制剂则减弱这一屏障保护效应。
eEVs中miR10a不显著影响止血但可降低血友病小鼠关节出血相关死亡率
在F8-/-小鼠隐静脉切开出血模型中，FVIIa释放的eEVs较生理盐水或对照eEVs略缩短止血时间，但差异无统计学意义，各组失血量亦无显著差别。加入miR10a抑制剂或向对照eEVs加载miR10a模拟物均未改变其止血潜能，提示miR10a对止血无影响。
然而，在针刺诱导的大量关节出血模型中，未经治疗小鼠死亡率达40–50%。对照eEVs无效，而FVIIa-eEVs显著降低死亡率；若含miR10a抑制剂，其保护作用明显减弱。值得注意的是，给予加载miR10a模拟物的对照eEVs的小鼠无一死亡，表明miR10a对改善生存具有关键作用。
参考文献：
Kavadipula P, Keshava S, Das K, Magisetty J, DeJong C, Penchalaneni J, Pendurthi U, Rao LVM. Factor VIIa-released extracellular vesicles attenuate joint bleed-induced hemophilic arthropathy. Blood. 2025 Aug 20:blood.2024027143. doi: 10.1182/blood.2024027143. PMID: 40834879.
