由严重急性呼吸综合症冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎疾病(COVID-19)，已成为近年来最大的全球大流行病，且随着新病毒感染的快速蔓延，对开发新的治疗方法的需求不断增加。细胞外囊泡(EVs)是具有潜力的生物兼容性药物载体；然而，其特异性和递送效率仍面临挑战。近日，来自京都大学化学研究所的研究人员开发了展示SARS-CoV-2刺突S蛋白的细胞外囊泡（命名为S-EVs 10K）作为一种新型的抑制SARS-CoV-2感染的方式。S-EVs 10K能够实现与表达 ACE2 的细胞的特异性膜融合，并利用表达 TMPRSS2 的 Vero E6 细胞高效递送编码 TMPRSS2 抑制蛋白 HAI-2 的 mRNA，实现了对SARS-CoV-2感染的抑制作用。相关内容以“SARS-CoV-2 inhibition through mRNA delivery using engineered extracellular vesicles displaying the spike protein”为题于8月4日在线发表在国际知名材料学学术期刊Biomaterials杂志上。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（新冠病毒，SARS-CoV-2）已经引发了新型冠状病毒病/肺炎（COVID-19）的大流行。尽管已经开发了抗体治疗、疫苗以及小分子药物用于治疗COVID-19，但对能够快速应对此类新兴病毒感染的新型治疗方式的需求仍在不断增长。SARS-CoV-2 通过其包膜上呈同源三聚体形式的刺突糖蛋白（S蛋白）入侵宿主细胞。S蛋白由 S1 和 S2 亚基组成，其中 S1 亚基包含宿主细胞受体人血管紧张素转化酶2（ACE2）的受体结合域（RBD），而 S2 亚基则包含融合肽和跨膜结构域。当 S 蛋白与细胞表面的受体结合后，S1 亚基会被跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）切割，从而激活 S2 亚基中的融合肽，触发病毒与宿主细胞膜的融合，并使病毒基因组RNA释放到宿主细胞内。此外，当病毒颗粒被内吞进入细胞后，内溶酶体蛋白酶 cathepsin 也可完成 S2 亚基的释放，促使病毒膜与内体膜融合，从而将病毒RNA释放至宿主细胞胞质中。
细胞外囊泡（EVs），包括外泌体、微囊泡和凋亡小体，是介导细胞间通讯的纳米级结构。EVs 可由多种细胞产生，包括免疫细胞、间充质干细胞、内皮细胞、上皮细胞以及癌细胞。它们携带多种货物，如蛋白质、DNA、RNA（包括 mRNA、microRNA（miRNA）以及长链非编码RNA），并且存在于多种体液中，如血浆、母乳、脑脊液、尿液。近年来的研究表明，EVs 在药物递送方面有广泛应用前景。由于 EVs 完全由生物成分组成，它们可能克服脂质体或纳米颗粒相关的毒性及快速清除问题。EVs 已被用于递送小干扰RNA、miRNA、mRNA以及蛋白质。其递送机制包括通过表面黏附蛋白或直接膜融合将货物传递给受体细胞。
为了实现对特定组织或细胞更具选择性的靶向，研究人员已将能够与受体细胞结合的特异性配体（如多肽、抗体和RNA适配体）修饰至EVs表面。此外，细胞吞噬作用（包括大吞饮作用）也参与EVs的摄取，并且通过加入可诱导大吞饮作用的多肽可以增强EVs的细胞摄取效率。然而，RNA 必须从 EVs 释放至胞质中才能发挥功能。事实上，即使 EVs 被受体细胞内吞，EVs 所包裹的 mRNA 往往只能带来极低的蛋白质表达，这表明内体逃逸或 mRNA 向胞质释放的关键性。因此，建立促进 EVs 包封的 mRNA 在胞质中释放的方法，对 EVs 作为递送载体的应用至关重要。
水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）可介导病毒附着和细胞膜融合。在 EVs 上展示 VSV-G 已被证实可提高递送效。研究团队之前建立了一种利用裂分荧光素酶系统定量检测 EVs 总摄取量及膜融合的方法，该系统由一个小的11个氨基酸肽片段“HiBiT”和一个18 kDa的大互补片段“LgBiT”组成。在未展示 VSV-G 的 EVs 中几乎观察不到膜融合，但在展示 VSV-G 的 EVs 中，膜融合效率显著提高。尤其是大尺寸EVs（lEVs，主要来自于质膜向外出芽形成的微囊泡），与细胞的融合效率高于小尺寸EVs（sEVs，主要来源于内体多泡体与质膜融合释放的外泌体），当这些 EVs 展示 VSV-G 时，其融合能力进一步增强。然而，VSV-G 介导的膜融合可在所有细胞类型中发生，难以实现细胞特异性。因此，为了开发可实际应用的 mRNA 或药物递送载体EVs，需要同时实现对靶细胞的选择性递送和高效膜融合，以便有效递送其中包裹的 mRNA 或药物。
SARS-CoV-2 的感染机制表明其主要感染同时表达 ACE2 和 TMPRSS2 的细胞。因此，研究团队假设表达 SARS-CoV-2 S 蛋白的 EVs 可以选择性地将表达治疗性蛋白的 mRNA 递送至易感的靶细胞，从而抑制病毒感染或增殖。此前已有研究在细菌 EVs或人工衣壳蛋白上展示 S 蛋白用于 SARS-CoV-2 疫苗或针对易感细胞的靶向，但尚无研究报道利用展示完整 S 蛋白的颗粒作为治疗手段，既能靶向 SARS-CoV-2 易感细胞以选择性递送 mRNA 或药物，又能促进与宿主细胞的融合。
在本研究中，研究人员开发了展示 S 蛋白的 EVs10K（S-EVs10K），作为一种新型抑制 SARS-CoV-2 感染的方法。通过10,000×g离心得到的沉淀部分S蛋白展示的细胞外囊泡(S-EVs10K)被发现能够选择性地结合表达ACE2的细胞。使用TMPRSS2和半胱氨酸蛋白酶等蛋白酶切割S蛋白后，S-EVs10K与靶细胞成功融合。使用TMPRSS2表达的Vero E6细胞进行病毒感染抑制剂实验，进一步确认了S-EVs10K在ACE2和TMPRSS2依赖性作用下的膜融合。此外，研究还展示了S-EVs10K作为新型mRNA载体的潜力，通过封装编码抑制TMPRSS2的膜蛋白HAI-2的mRNA，抑制SARS-CoV-2的感染。通过伪型病毒样颗粒的实验，确认了SARS-CoV-2在TMPRSS2表达的Vero E6细胞中的进入被显著抑制。这些发现表明，S-EVs10K通过膜融合实现特异性mRNA递送至靶细胞，作为一种新型的通过递送编码抑制蛋白的mRNA来抑制SARS-CoV-2感染的方法。
参考文献：SARS-CoV-2 inhibition through mRNA delivery using engineered extracellular vesicles displaying the spike protein. Biomaterials. 2026 Feb;325:123594.
