外膜囊泡（Outer membrane vesicles，OMVs）是由革兰氏阴性菌天然分泌的纳米级囊泡，被认为是一种极具前景的疫苗开发平台。由于携带病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），OMVs具有固有的免疫刺激特性，能够提供自佐剂功能，并诱导先天性和适应性免疫反应。最近的一篇文献综述了OMVs相较于传统疫苗策略的优势，包括其安全性、模块化特征，以及通过基因工程实现靶向抗原递送的潜力。该综述介绍了提升OMVs产量和免疫原性的方法，例如减少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）毒性的改造，以及通过 ClyA、Lpp-OmpA、AIDA-I、Hbp 和 Sec/Tat信号肽等融合构建体实现抗原定位于囊泡表面或囊泡腔内的系统。作者进一步总结了基于 OMVs 的疫苗在细菌病原体、病毒感染及肿瘤等方面的临床前应用。此外，还讨论了大规模生产、纯化和长期稳定性方面的关键挑战，并探讨了异源抗原偶联或包封的策略。总体而言，OMVs 作为一种多功能、可扩展的细胞外囊泡平台，展现出在下一代疫苗开发中用于多种传染病及其他领域的巨大潜力。
1.革兰氏阴性菌细胞外囊泡的多样性
细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）存在于三大生命领域的生物中，在细胞间通信、应激环境下的生存与保护以及病原过程中发挥重要作用。革兰氏阴性菌的 EV 最早在 1965 年被观察到，主要通过外膜出芽形成，被称为外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs）。OMVs 具有多种功能，例如输出代谢废物、缓解渗透压、远程递送毒素促进致病性、炎症环境下获取铁等。此外，由于 OMVs 的组成与细菌外膜相似，包含脂多糖（LPS）、磷脂和外膜蛋白，它们还能作为“诱饵”抵御噬菌体或宿主抗菌因子。
除 OMVs 外，革兰氏阴性菌还可产生其他类型的囊泡。外-内膜囊泡（Outer-Inner Membrane Vesicles, O-IMVs）于 2013年首次报道，由内膜穿过肽聚糖层并与外膜共同出芽形成，因而含有胞质和周质成分，甚至可能携带质粒 DNA。另一类为爆裂囊泡（Explosive OMVs, EOMVs），其产生机制与环境压力相关。当 SOS 应答不足以维持细菌生存时，细胞裂解并释放胞质、周质及细胞壁成分，最终被膜片包裹形成 EOMVs。尽管其比例较低，但在病原菌适应应激中具有重要意义。
在多种 EV 类型中，OMVs 近年来受到广泛关注，特别是作为疫苗平台的潜力。与减毒或灭活细菌疫苗相比，OMVs 具有免疫原性强、自带佐剂作用且无法复制等优势。随着基因工程的发展，研究者能够定向调控 OMVs 的性质与抗原呈递方式，从而提高免疫应答效果。
本文综述聚焦于革兰氏阴性菌 OMVs 作为疫苗平台的研究进展，讨论其抗原定位系统、规模化生产的挑战（如纯化、安全性、稳定性），并评估不同菌株在 OMVs 疫苗开发中的适用性。最后，还将展望 OMVs 在新发病原体防治及肿瘤免疫治疗中的应用前景。
- OMVs的结构与组成
外膜囊泡（OMVs）是由革兰氏阴性菌外膜出芽产生的球形纳米颗粒，大小约20–250 nm。革兰氏阴性菌包膜由内膜（IM）、外膜（OM）及其间的周质层构成。外膜具有不对称结构，内层主要为磷脂，外层则含有脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMPs）及表面结构如菌毛。LPS分为光滑型和粗糙型，光滑型由O-抗原、多糖核心及脂质A三部分组成，其中O-抗原高度可变并为宿主抗体主要靶点。缺失O-抗原的称为粗糙型LPS，而进一步缺失核心的则为深粗糙型LPS。一些细菌不含O-抗原而产生类脂寡糖（LOS），其结构类似粗糙型LPS，但由独立途径合成，通常含有更短的寡糖链，且可通过唾液酸化修饰实现免疫逃逸。
OMVs的脂质和蛋白组成与细菌外膜相似，外层含有LPS/LOS、菌毛及纤毛，内层主要为磷脂，OMPs和脂蛋白嵌入双层中。鞭毛素等结构蛋白也可在鞭毛菌的OMVs中富集。OMVs腔内包含周质蛋白和肽聚糖碎片，但不含DNA、RNA或胞质蛋白，这一特性使其区别于外-内膜囊泡（O-IMVs）或爆裂囊泡（EOMVs）。因此，OMVs在疫苗开发中具有更高的安全性，因为其不携带可能导致毒素产生或耐药基因水平转移的遗传物质。
细菌维持细胞包膜完整性的机制包括：LPS的静电排斥维持外膜刚性、部分OMPs及脂蛋白通过与肽聚糖的共价连接稳定细胞壁、以及外膜磷脂的不对称分布。当这些机制受扰时，会促进外膜出芽并产生OMVs。此外，外膜中不同几何构型的脂质（圆柱形、锥形等）形成具有不同曲率的微区，从而促进局部出芽。OMVs的组成和内容可随形成机制的不同而调节，这一方面与其规模化生产和生物工程改造密切相关。
- OMVs的免疫原性与佐剂特性
佐剂是能增强抗原免疫应答并提高疫苗效力的化合物。OMVs的组成与母体细菌外膜相似，含有LPS或LOS、外膜蛋白、脂蛋白、磷脂及鞭毛素等，同时腔内含有周质成分。这些分子中有些属于病原体相关分子模式（PAMPs），赋予OMVs自佐剂特性。
LPS是OMVs表面的主要免疫刺激物，可被免疫细胞表面的TLR4识别，激活MyD88依赖与TRIF依赖通路，进一步通过NF-κB诱导炎症因子如TNF-α、IL-6、IFN-β、IL-1β和IL-18的表达。同时，NF-κB促进NLRP3炎性小体的形成。该复合物包括NLRP3、ASC及前体caspase-1，激活后导致IL-1β和IL-18成熟释放。此外，OMVs进入宿主细胞后，其LPS还可通过caspase-4/5（小鼠中为caspase-11）启动非经典炎性小体通路，最终导致gasdermin D裂解、膜孔形成和细胞焦亡，从而进一步释放细胞因子调控免疫反应。LOS与LPS作用机制相似，也能激活TLR4及NLRP3炎性小体，发挥佐剂效应。
除LPS/LOS外，OMVs中其他PAMPs也可通过不同TLRs被识别，例如TLR1/2识别三酰基脂蛋白，TLR2/6识别二酰基脂蛋白和孔蛋白，TLR5识别鞭毛素，这些作用同样通过NF-κB通路诱导炎症反应。与此同时，胞质受体如NOD1和NOD2可识别OMVs腔内的肽聚糖，进一步激活NF-κB和MAPK通路，引发炎症应答。
综上，OMVs相关PAMPs可激活宿主多种模式识别受体，促进先天免疫反应，并通过抗原递呈有效启动适应性免疫，从而诱导针对病原体的强大特异性免疫应答。
- OMVs的免疫应答
OMVs直径为20–250 nm，能够直接进入淋巴管并到达淋巴结，在此由树突状细胞或窦状巨噬细胞等抗原提呈细胞（APCs）处理并激活T细胞和B细胞，从而启动细胞和体液免疫。OMVs作为抗原载体的优势在于既易被APCs摄取，又可直接进入淋巴系统，诱导强效适应性免疫反应。
在接种疫苗或感染后，初始T、B细胞分化为短寿命效应细胞和长寿命记忆细胞。记忆细胞在再次暴露于同源抗原时能迅速扩增，提供更高效的免疫保护。因此，OMVs既能诱导即时免疫，又能建立持久免疫记忆。
体液免疫主要通过抗体应对细胞外病原体，而细胞免疫则针对胞内病原体，二者常需协同以获得最佳保护。抗原定位方式影响免疫偏向：表面抗原通常更易诱导B细胞活化和体液免疫，而腔内抗原多激发细胞免疫。然而，研究表明表面抗原亦可通过交叉提呈途径激活CD8+ T细胞，而腔内抗原在吞噬作用释放后也能刺激B细胞，显示免疫应答具有交叉性和互补性。根据病原特性，疫苗策略可调控免疫取向偏向Th1（细胞免疫，IgG2a>IgG1）或Th2（体液免疫，IgG2a<IgG1）。
免疫应答还受接种途径影响。腹腔、肌肉或皮下注射常诱导系统性IgG反应，但对黏膜感染的防护有限。若需产生黏膜sIgA抗体，则需黏膜途径，如鼻内或口服OMVs疫苗，可有效抵御呼吸道或肠道病原体感染。
综上，OMVs凭借其纳米特性与抗原可塑性，能够灵活调控体液与细胞免疫，是疫苗开发的重要平台。
5.用作疫苗的不同类型OMVs
根据靶标病原体的不同，OMVs疫苗可来自野生型（WT）病原菌或经基因工程改造的菌株。WT-OMVs通常携带与母体细菌血清群特异的O-抗原，能诱导针对该病原体的免疫应答。例如，来源于禽致病性大肠杆菌（APEC）的OMVs可在鸡群中诱导针对O1、O2、O78等血清群的体液与细胞免疫反应，提供针对禽大肠杆菌病的保护。志贺菌（Shigella）OMVs混合疫苗在小鼠中可诱导广谱保护。百日咳病原体百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）的OMVs疫苗候选物（Avacc 3）已在动物实验中显示出全身及黏膜免疫应答，并进入商业化开发。霍乱弧菌（Vibrio cholerae）O1来源的OMVs在小鼠中能诱导抗体反应，但保护性仅限于相同血清群。
与WT-OMVs相比，生物工程化OMVs（b-OMVs）通过在囊泡上展示同源或异源抗原，可突破O-抗原局限，诱导更广谱免疫。典型例子包括针对脑膜炎奈瑟菌B群的4CMenB（Bexsero）疫苗，利用基因改造菌株同时呈递NHBA、fHbp、NadA及PorA抗原，已在全球多个国家获批并降低了发病率。其他研究显示，改造铜绿假单胞菌产生的OMVs可携带融合抗原PcrV-HitAT，诱导体液与细胞免疫并对多株菌株产生保护。针对金黄色葡萄球菌的b-OMVs在小鼠模型中诱导功能性抗体，提供多部位感染防护。更进一步，N. meningitidis工程菌株被用于展示新冠病毒S蛋白，动物实验中显示出抗体应答与保护效果，已获批进入临床I期试验。
总体而言，无论是WT-OMVs还是b-OMVs，均展现出作为新一代疫苗平台的潜力，其开发方向取决于靶病原体的多样性与所需免疫应答类型。
不同类型的外膜囊泡（OMVs）及其免疫原性与佐剂特性
参考文献：
Garling A, Auvray F, Epardaud M, Oswald É, Branchu P. Outer Membrane Vesicles as a Versatile Platform for Vaccine Development: Engineering Strategies, Applications and Challenges. J Extracell Vesicles. 2025 Sep;14(9):e70150. doi: 10.1002/jev2.70150. PMID: 40919883; PMCID: PMC12415872.
外泌体资讯网 【综述】细菌外膜囊泡作为多功能疫苗开发平台
